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請幫忙分析一下，非常感謝~ 已有7人參與
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各位好，小弟近來在做質粒構建，遇到一些問題，請賜教~ 原始質粒是從菌液里提出來的pET-28a；目的片段2200左右，上下游引物5'端分別加的是Bamh I和Ecor I的酶切位點，然后也都加好了Neb那張表格的保護堿基，都加了3個保護堿基，PCR條帶也都正確，并割膠回收。 然后，質粒和目的片段37度4h雙酶切，酶切體系12ul DNA；2ul Buffer K；4.4ul ddH20；0.8ul Bamh I；0.8ul Ecor I，電泳如圖1，最左面的是2000的Marker，最右面的是原始質粒。 接著割膠回收，如圖2，取割膠回收6.5ul 目的片段和1.5ul 質粒，再加1ul buffer和1ul 連接酶，16度連接20個小時，然后就做轉化，感受態(tài)效率還可以，明天過來，長了30個左右，晚上接菌，并且在抗生素的培養(yǎng)基里都長了。 但是今天提質粒又是沒提出來，已經(jīng)做了好幾次了，這是為什么？試劑盒、限制酶和連接酶都是用的Takara的。 看了原始質粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位點是緊挨著的，是不是不能雙酶切？ 請不吝賜教，非常感謝~ 雙酶切產(chǎn)物.gif 雙酶切割膠回收.gif |
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5樓2014-08-02 20:14:30
yuzhiming
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2樓2014-08-02 14:27:25
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luwei13566
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【答案】應助回帖
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1.你篩選平板上長的轉化子是壓根沒提出來質粒還是里面有質粒只不過是空載的？ 2.質粒上兩個酶切位點挨著確實比一般的難切，但不是切不開，需要延長切割時間或者分步酶切。 3.從電泳圖上看你的基因濃度遠遠不夠。割膠回收后檢測連條帶都沒了，一是你酶切的基因和載體太少，回收前得多切幾管，其次你膠回收率太低，可以用PCR產(chǎn)物純化代替割膠回收，最后純化后的基因和載體最好要檢測濃度，基因載體摩爾比不好自然影響連接效率 |
4樓2014-08-02 17:02:04
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