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ayouyiyi新蟲 (初入文壇)
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[求助]
請(qǐng)幫忙分析一下，非常感謝~ 已有7人參與
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各位好，小弟近來(lái)在做質(zhì)粒構(gòu)建，遇到一些問題，請(qǐng)賜教~ 原始質(zhì)粒是從菌液里提出來(lái)的pET-28a；目的片段2200左右，上下游引物5'端分別加的是Bamh I和Ecor I的酶切位點(diǎn)，然后也都加好了Neb那張表格的保護(hù)堿基，都加了3個(gè)保護(hù)堿基，PCR條帶也都正確，并割膠回收。 然后，質(zhì)粒和目的片段37度4h雙酶切，酶切體系12ul DNA；2ul Buffer K；4.4ul ddH20；0.8ul Bamh I；0.8ul Ecor I，電泳如圖1，最左面的是2000的Marker，最右面的是原始質(zhì)粒。 接著割膠回收，如圖2，取割膠回收6.5ul 目的片段和1.5ul 質(zhì)粒，再加1ul buffer和1ul 連接酶，16度連接20個(gè)小時(shí)，然后就做轉(zhuǎn)化，感受態(tài)效率還可以，明天過來(lái)，長(zhǎng)了30個(gè)左右，晚上接菌，并且在抗生素的培養(yǎng)基里都長(zhǎng)了。 但是今天提質(zhì)粒又是沒提出來(lái)，已經(jīng)做了好幾次了，這是為什么？試劑盒、限制酶和連接酶都是用的Takara的。 看了原始質(zhì)粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位點(diǎn)是緊挨著的，是不是不能雙酶切？ 請(qǐng)不吝賜教，非常感謝~ 雙酶切產(chǎn)物.gif 雙酶切割膠回收.gif |
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1.你篩選平板上長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子是壓根沒提出來(lái)質(zhì)粒還是里面有質(zhì)粒只不過是空載的？ 2.質(zhì)粒上兩個(gè)酶切位點(diǎn)挨著確實(shí)比一般的難切，但不是切不開，需要延長(zhǎng)切割時(shí)間或者分步酶切。 3.從電泳圖上看你的基因濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。割膠回收后檢測(cè)連條帶都沒了，一是你酶切的基因和載體太少，回收前得多切幾管，其次你膠回收率太低，可以用PCR產(chǎn)物純化代替割膠回收，最后純化后的基因和載體最好要檢測(cè)濃度，基因載體摩爾比不好自然影響連接效率 |
4樓2014-08-02 17:02:04
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ayouyiyi(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-03 19:05:16
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1.如果提質(zhì)粒酶問題那就好好篩查一下你的氨芐吧。。。就拿你這次做的感受態(tài)細(xì)胞接種到你抗性培養(yǎng)基里試試長(zhǎng)不長(zhǎng)菌。 2.我們實(shí)驗(yàn)室不用28a，選哪個(gè)酶切位點(diǎn)關(guān)鍵要看你需要連接的片段序列，要不是序列里有切點(diǎn)你也不會(huì)選兩個(gè)愛一起的酶切位點(diǎn)做切割吧。。 |
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ayouyiyi8樓2014-08-02 23:38:34
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llj4212008
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PET是表達(dá)載體，都是低拷貝的質(zhì)粒，你測(cè)一下濃度，切2ug的量，如果不測(cè)的話，你的DNA量加30ul，酶各1ul，切2h，片段切的時(shí)候也多切點(diǎn)，然后膠回回收或片段純化，連接時(shí)間1h-過夜都可以，試試看，祝順利！ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
10樓2014-08-03 22:16:57
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