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想要證明一個啟動子是受到氧氣調(diào)控，怎么設(shè)計基因敲除？ 已有1人參與
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我們做微生物，想證明一株叫做HS01的嗜水氣單胞菌其中一個啟動子受到氧氣刺激而調(diào)控（我們知道這個啟動子的序列），即有氧氣的時候它就會調(diào)控后續(xù)基因表達，沒有氧氣就不表達。 我們應該證明哪幾點？ 一：要證明氧氣可以調(diào)控這個啟動子 二：要證明氧氣不是直接作用在下游序列上，而是啟動子上。 我們打算這么做： 1：我們想把這段啟動子序列導入到質(zhì)粒當中，讓它調(diào)控另一段基因的表達，比如某個顯色的基因，看看是不是這個顯色基因也受氧氣影響，那就證明了這段啟動序列是受氧氣調(diào)控的。即證明第一點。 2：我們想用一個新的啟動子，比如受光控制的啟動子，與原有的啟動子的上下游序列構(gòu)建一個質(zhì)粒，即用新啟動子代替原來的，然后將這個質(zhì)粒導入到已敲除原啟動序列的HS01當中，得到一株新的敲除菌。新菌不再受氧氣調(diào)控，而是受光調(diào)控，這樣就證明了氧氣是作用在啟動子上，而不是下游序列上。證明第二點。 有個國外實驗室給我們回郵件，說可以這么做，我覺得這只能證明我所說的第一點，各位看看： Alternatively, we can structure a donor plasmid with following sequence(也就是構(gòu)建一個換掉啟動子序列的質(zhì)粒). and a crispr/cas9 palsmid targets to your regulator. Then ,you transform the plasmids into Aeromonas hydrophila strain s1. You will achieve the purpose of the experiment. 我說的方案需要構(gòu)建兩株突變菌，我說的那樣做對嗎？有必要那么麻煩嗎？ 外國實驗室這樣做，只需要構(gòu)建一株突變菌，對嗎？能證明氧氣的調(diào)控嗎？ |
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kuaile5420
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| 您好，個人感覺您設(shè)計的第二個敲除菌意義不大，感覺重新梳理一下實驗思路會好一些。首先我們要明確的是氧氣是直接作用在啟動子上還是通過相關(guān)途徑產(chǎn)生某種物質(zhì)來與啟動子結(jié)合進行基因調(diào)控？這個貌似沒有相關(guān)文獻記載氧氣可以直接作用在啟動子上，因此是通過相關(guān)途徑產(chǎn)生某種物質(zhì)來進行基因調(diào)控的。因此要確定的是氧氣作用后產(chǎn)生了那個物質(zhì)。希望這樣回答會對您的實驗設(shè)計有所幫助。期待進一步交流。 |
2樓2014-08-08 17:48:16
3樓2014-08-09 09:31:00
kuaile5420
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-08-20 09:50:19
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第一個敲出菌是有意義的啊，可以通過該顯色基因的表達來確定是否氧氣對該啟動子進行了調(diào)控。不知道你用的是那個菌，這里有篇文章，希望對您有幫助。http://wenku.baidu.com/view/1166b559c850ad02de8041df.html 里面提到了氧化應激反應對.http://wenku.baidu.com/view/d1d322d59b89680203d82579.html ,這個Ppt中也說到了氧化應激反應對基因影響效應。你可以查一下相關(guān)的文獻確定氧氣對啟動子調(diào)控機理，然后進行設(shè)計實驗。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
wuyundang4樓2014-08-10 10:18:27
5樓2014-08-11 09:47:47
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您好為什么要導入其他新的菌？新的菌不是該種菌株吧？有些啟動子可以在新的菌株中使用，但有些也許根本不能使用呀。給你提供幾個方案，你可以參考一下。我們的目的在于檢測有無氧氣作用是該啟動子對相關(guān)基因的調(diào)控。方案一，我們可以在該菌中該啟動子所調(diào)控的基因中加入顯色基因（利用限制性內(nèi)切酶酶切然后連接起來），這樣就沒有改變菌種，可以在有氧和無氧條件下看該基因是否表達顯色蛋白來，從而確定有無氧氣作用是該啟動子對相關(guān)基因的調(diào)控。方案二，假如我們知道該啟動子控制的基因，我們可以利用定量pcr來檢測有無氧氣是該基因的表達情況的變化。 |
6樓2014-08-11 11:23:58
7樓2014-08-12 22:10:27
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