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想要證明一個(gè)啟動(dòng)子是受到氧氣調(diào)控，怎么設(shè)計(jì)基因敲除？ 已有1人參與
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我們做微生物，想證明一株叫做HS01的嗜水氣單胞菌其中一個(gè)啟動(dòng)子受到氧氣刺激而調(diào)控（我們知道這個(gè)啟動(dòng)子的序列），即有氧氣的時(shí)候它就會(huì)調(diào)控后續(xù)基因表達(dá)，沒有氧氣就不表達(dá)。 我們應(yīng)該證明哪幾點(diǎn)？ 一：要證明氧氣可以調(diào)控這個(gè)啟動(dòng)子 二：要證明氧氣不是直接作用在下游序列上，而是啟動(dòng)子上。 我們打算這么做： 1：我們想把這段啟動(dòng)子序列導(dǎo)入到質(zhì)粒當(dāng)中，讓它調(diào)控另一段基因的表達(dá)，比如某個(gè)顯色的基因，看看是不是這個(gè)顯色基因也受氧氣影響，那就證明了這段啟動(dòng)序列是受氧氣調(diào)控的。即證明第一點(diǎn)。 2：我們想用一個(gè)新的啟動(dòng)子，比如受光控制的啟動(dòng)子，與原有的啟動(dòng)子的上下游序列構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，即用新啟動(dòng)子代替原來(lái)的，然后將這個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入到已敲除原啟動(dòng)序列的HS01當(dāng)中，得到一株新的敲除菌。新菌不再受氧氣調(diào)控，而是受光調(diào)控，這樣就證明了氧氣是作用在啟動(dòng)子上，而不是下游序列上。證明第二點(diǎn)。 有個(gè)國(guó)外實(shí)驗(yàn)室給我們回郵件，說(shuō)可以這么做，我覺得這只能證明我所說(shuō)的第一點(diǎn)，各位看看： Alternatively, we can structure a donor plasmid with following sequence(也就是構(gòu)建一個(gè)換掉啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒). and a crispr/cas9 palsmid targets to your regulator. Then ,you transform the plasmids into Aeromonas hydrophila strain s1. You will achieve the purpose of the experiment. 我說(shuō)的方案需要構(gòu)建兩株突變菌，我說(shuō)的那樣做對(duì)嗎？有必要那么麻煩嗎？ 外國(guó)實(shí)驗(yàn)室這樣做，只需要構(gòu)建一株突變菌，對(duì)嗎？能證明氧氣的調(diào)控嗎？ |
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kuaile5420
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【答案】應(yīng)助回帖
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wuyundang: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2014-08-12 22:07:18
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| 您好，個(gè)人感覺您設(shè)計(jì)的第二個(gè)敲除菌意義不大，感覺重新梳理一下實(shí)驗(yàn)思路會(huì)好一些。首先我們要明確的是氧氣是直接作用在啟動(dòng)子上還是通過(guò)相關(guān)途徑產(chǎn)生某種物質(zhì)來(lái)與啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)行基因調(diào)控？這個(gè)貌似沒有相關(guān)文獻(xiàn)記載氧氣可以直接作用在啟動(dòng)子上，因此是通過(guò)相關(guān)途徑產(chǎn)生某種物質(zhì)來(lái)進(jìn)行基因調(diào)控的。因此要確定的是氧氣作用后產(chǎn)生了那個(gè)物質(zhì)。希望這樣回答會(huì)對(duì)您的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有所幫助。期待進(jìn)一步交流。 |
2樓2014-08-08 17:48:16
3樓2014-08-09 09:31:00
kuaile5420
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第一個(gè)敲出菌是有意義的啊，可以通過(guò)該顯色基因的表達(dá)來(lái)確定是否氧氣對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行了調(diào)控。不知道你用的是那個(gè)菌，這里有篇文章，希望對(duì)您有幫助。http://wenku.baidu.com/view/1166b559c850ad02de8041df.html 里面提到了氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì).http://wenku.baidu.com/view/d1d322d59b89680203d82579.html ,這個(gè)Ppt中也說(shuō)到了氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)基因影響效應(yīng)。你可以查一下相關(guān)的文獻(xiàn)確定氧氣對(duì)啟動(dòng)子調(diào)控機(jī)理，然后進(jìn)行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
wuyundang4樓2014-08-10 10:18:27
5樓2014-08-11 09:47:47
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您好為什么要導(dǎo)入其他新的菌？新的菌不是該種菌株吧？有些啟動(dòng)子可以在新的菌株中使用，但有些也許根本不能使用呀。給你提供幾個(gè)方案，你可以參考一下。我們的目的在于檢測(cè)有無(wú)氧氣作用是該啟動(dòng)子對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控。方案一，我們可以在該菌中該啟動(dòng)子所調(diào)控的基因中加入顯色基因（利用限制性內(nèi)切酶酶切然后連接起來(lái)），這樣就沒有改變菌種，可以在有氧和無(wú)氧條件下看該基因是否表達(dá)顯色蛋白來(lái)，從而確定有無(wú)氧氣作用是該啟動(dòng)子對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控。方案二，假如我們知道該啟動(dòng)子控制的基因，我們可以利用定量pcr來(lái)檢測(cè)有無(wú)氧氣是該基因的表達(dá)情況的變化。 |
6樓2014-08-11 11:23:58
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8樓2014-08-19 21:38:58
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