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dongjiqiao鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
DEAE FF 純化商品酶，只有一個(gè)峰 已有2人參與
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實(shí)驗(yàn)（1）上樣緩沖液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脫緩沖液：Tris-Hcl +1.0 M Nacl，pH 7.0 ，進(jìn)樣2ml/次，共兩次，洗脫時(shí)，0-100%，這時(shí)峰就一起出來(lái)了。（第一次做實(shí)驗(yàn)，緩沖液也沒(méi)有抽濾，出現(xiàn)了毛刺峰，這個(gè)問(wèn)題之前請(qǐng)教過(guò)大家了） 實(shí)驗(yàn)（2）上樣緩沖液：Tris-Hcl +0.01M Nacl，pH 7.0 ，洗脫緩沖液：Tris-Hcl +0.5M Nacl，pH 7.0 ，進(jìn)樣2ml/次，共兩次，洗脫時(shí)，0-30%，30%-70%,705-100%，但是只在低鹽濃度時(shí)有一個(gè)峰出現(xiàn)，后面的就沒(méi)有峰了，柱子上有很重的顏色沒(méi)有洗下來(lái)。 關(guān)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，有幾點(diǎn)不明白的地方：1、實(shí)驗(yàn)（1）中的峰在50%洗脫時(shí)差不多都洗脫下來(lái)了，為什么實(shí)驗(yàn)（2）中在相當(dāng)濃度（70%-100%）時(shí)反而沒(méi)有樣品洗下來(lái)呢？是不是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)（1）梯度射的陡了？ 2、吸附在柱子上的顏色較重的樣品，后面用水沖洗，能下下來(lái)一部分，再用20%乙醇沖洗，大部分洗下來(lái)了，但是還有一些洗不掉了。問(wèn)過(guò)一個(gè)老師，他說(shuō)可能是我的緩沖液不合適，但是我查了下，pH7.0 的緩沖液，GE 柱子說(shuō)明書(shū)上推薦的，pH6.0-7.0 的是 bis-tris,pH 6.2-7.2 的是 bis-tris propane ,我查了下， bis-tris是1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]甲烷， bis-tris propane是1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷。這些緩沖液差別應(yīng)該和tris差不多吧？ 3、上樣緩沖液是不是該添加Nacl呢？不加的話(huà)是不是有疏水作用，影響吸附？ 0.5M 洗脫緩沖液.JPG 1M 洗脫緩沖液.JPG |
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dongjiqiao
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2樓2014-08-14 09:34:15
yuanbo934
至尊木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
dongjiqiao: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝指導(dǎo)！ 2014-08-19 14:04:47
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| 從電導(dǎo)的變化上看，柱子里有氣泡了，為什么不手動(dòng)梯度洗脫，而用線(xiàn)性洗脫？線(xiàn)性洗脫分離不好，就是方便。梯度洗脫可以自己控制鹽的濃度，分離的別較好。（1）蛋白的洗脫，這和離子濃度與流速有關(guān)（2）洗脫不下來(lái)的可能也有色素存在，可考慮用0.5的氫氧化鈉清洗，具體方法可以見(jiàn)柱子的再生。（3）添加Nacl影響并不大。我們一般用泵進(jìn)樣，這樣可以進(jìn)入大量發(fā)酵液，我曾經(jīng)直接進(jìn)入過(guò)兩升發(fā)酵液，這樣目的蛋白會(huì)很多，然后用手動(dòng)洗脫每次增加5%的鹽濃度，洗到50%后改用線(xiàn)性洗脫，一般50%后我的目的蛋白幾乎沒(méi)有了。 |
3樓2014-08-14 19:07:34
wolfman840
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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給你幾個(gè)建議： 1，實(shí)驗(yàn)（1）的線(xiàn)性洗脫體積不夠，從圖譜上看，沒(méi)分開(kāi)，峰有平臺(tái)期。建議你用30CV進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫后，做peak cutting。 2.上樣別加NaCl，Cl離子是DEAE的標(biāo)準(zhǔn)反離子，影響吸附。 3. 調(diào)節(jié)pH，上樣pH在等電點(diǎn)以上，洗脫pH在等電點(diǎn)以下。這個(gè)你看一下GE的陰離子交換層析手冊(cè)。 4. 0.5M的線(xiàn)性梯度還可以?xún)?yōu)化一下，如果只有一個(gè)峰的話(huà)，證明離子強(qiáng)度太低，還有東西在柱子上沒(méi)洗下來(lái)。 |
4樓2014-08-15 17:33:24
dongjiqiao
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6樓2014-08-19 14:40:07
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