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[求助]
求助：一般抗原處理的辦法由那些？ 已有2人參與
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現(xiàn)在遇到一個問題：抗原的特異性不高，和陽性的樣品約有三分之一呈非反應(yīng)性。嘗試過多種抗原，抗原之間沒有太大的差異。懷疑可能是抗原的空間結(jié)構(gòu)，或者是抗原的決定簇沒有暴露出來。各位蟲友有沒有一些處理抗原或者蛋白的方法可以借鑒一下。還有一個就是后期抗原需要交聯(lián)堿性磷酸酶，目前還不知道是否對決定簇會有覆蓋，歡迎做過的蟲友指導(dǎo)。 PS：金幣不多，暫且放上50個bb吧。 |
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4樓2014-08-22 16:30:53
zhenwuhuang
至尊木蟲 (文學泰斗)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
賦文小子: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 謝謝，在問下有沒有單獨處理抗原的辦法，既能保持其活性，又能夠改變一下其結(jié)構(gòu) 2014-08-22 13:10:11
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常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介 來源： 龔紅娟的日志 常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶聯(lián)） 1、混合酸酐法，也稱氯甲酸異丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶聯(lián)時，半抗原分子中的羧基可與氯甲酸異丁酯在有機溶劑中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵。 氨甲喋呤（MIT）與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷卻至10度，加2ul氯甲酸異丁酯，10度攪拌反應(yīng)30分鐘。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反應(yīng)4小時（必要時加NaOH,以維持溶液的pH為9.0，q然后4度過夜。 4、過sephadex G-25層析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巰基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸緩沖液(pH7.5)平衡和洗脫，合并含酶的洗脫管內(nèi)液體，進一步純化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的緩沖液中。 2、碳化二亞胺法制備3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血藍蛋白免疫原的操作步驟 1、 取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、 取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、 取血藍蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、 將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、 室溫下避光攪拌1小時，逐滴加入余下的I液 6、 4度攪拌12小時 7、 靜置10小時（4度） 8、 有蒸餾水使之充分透析（約48小時），得免疫原。 3、孕酮與與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的N-羥琥珀酰亞胺酯法 1、 用二堊烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成濃度為100m mol/L的溶液。 2、 加羥琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二環(huán)已基碳化二亞胺），200 m mol/L, 4度反應(yīng)16小時。 3、 用簿層掃描方法純化(氯仿：水=9：1) 4、 按孕酮/酶摩爾濃度比約為10的比例，將上述溶液加入到酶液（用pH7.4，濃度50 m mol/L的磷酸緩沖液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián) 1、芳香胺類半抗原與蛋白質(zhì)重氮化偶聯(lián)的操作步驟 1、 用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L濃度的半抗原。 2、 滴加1％NaNO2(過量)，4度持續(xù)攪拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物試紙或在白色磁磚上加1％淀粉和50m mol/L KI進行監(jiān)控。游離亞硝酸可將氧化物氧化成碘，碘再與淀粉反應(yīng)變成藍黑色。 3、 溶液變成藍黑色后，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。 4、 用pH9.0、濃度為200m mol/L的硼酸或碳酸緩沖液溶解蛋白。 5、 邊攪拌，邊加入重氮化的半抗原（防止局部發(fā)生酸過量現(xiàn)象），調(diào)節(jié)pH到9.5。 6、 冰箱中攪拌反應(yīng)2小時，不斷調(diào)節(jié)pH到9.0。 7、 用PBS透析2天 8、 -20度保存（濃度為20mg/mL） 雙功能的酰亞胺酯(imidate esters)可以氨基反應(yīng)，形成脒。例如：用二甲基已二酰亞胺酯(dimethyladipimide)將去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)。 2、、應(yīng)用雙功能酰亞胺酯（imidate esters）制備去甲基三正喋呤-與β-半乳糖苷酶標記特的操作步驟 1、 用含5％（W/V）N-乙基嗎啉的無水甲醇0.4ml,在室溫下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亞胺酯(dimethyladipimide)(A液) 2、 取與β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸緩沖液（含MgCl2 10m mol/L,2-巰基乙醇 10 m mol/L 0.1ml(B液) 3、 將A液倒入B液。 4、 20度反應(yīng)90分鐘后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巰基乙醇 10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸緩沖液(50m mol/L) 1ml, 終止反應(yīng)。 5、 過sephadex G-25, 去除小分子物質(zhì)，得酶標記物（約75％的酶與半抗原結(jié)合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )進行偶聯(lián)，則只有15％的酶與之結(jié)合。 （三）含巰基半抗原的偶聯(lián) 可用馬來酰亞胺方法與蛋白偶聯(lián)。此外，將載體蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或?qū)⑤d體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中，通過過氧化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上。 （四）含羥基的半抗原偶聯(lián) 醇類羥基通過形成半琥珀酸酯轉(zhuǎn)化為羧基的操作步驟 1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。 2、 加熱回流1小時。 3、 減壓蒸餾去溶劑，,殘余物用5% NaHCO3水溶液溶解。 4、 用乙醚洗滌兩次，然后用H2SO4進行s酸化（pH到2.0）. 5、 用水洗滌固形物（為三氯乙基半琥珀酸酯）兩次，用氯仿-已烷使其結(jié)晶（產(chǎn)量約75％，熔點88-89度） 6、 取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亞硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加熱30分鐘。 7、 減壓蒸發(fā)，干燥1小時（高度真空條件下）。 8、 將上述產(chǎn)生（2，2，2-三氯憶基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室溫攪拌反應(yīng)2小時。 9、 65度真空蒸發(fā)后，用異丙醇使結(jié)晶析出來（得鹽酸化的結(jié)晶---5`-酯約84％，熔點160度）。 10、用溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，這樣引和的羧基可與蛋白質(zhì)偶聯(lián)（如用碳化二亞胺化）。 半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的操作步驟 1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反應(yīng)30分鐘。 2、 加1滴乙二醇(得A液) 3、 將A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L N |
2樓2014-08-21 13:09:32
3樓2014-08-22 13:05:54
蔡小蕾99
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