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lywachieve至尊木蟲 (著名寫手)
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[求助]
急 分子克隆遇到問題
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目前一直在做酶分子的定向進(jìn)化，但是所做分子克隆部分三個(gè)月以來一直不成功；因?yàn)檫@是后續(xù)試驗(yàn)基礎(chǔ)，懇請大家提出寶貴建議，不勝感激； 本人是應(yīng)用易錯(cuò)PCR方法改造目的基因；即通過改變PCR體系中各組分的比例如Mg離子濃度，添加Mn離子等，模擬自然進(jìn)化引入錯(cuò)配堿基，從而改變酶的性狀。而在此之前已有公司合成載體PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已經(jīng)把目的片段全長與載體連接完成）；而導(dǎo)師的計(jì)劃是先改造目的片段的控制水解酶性狀的一部分（即目的片段部分長度）；由公司設(shè)計(jì)針對此部分片段的引物；本人進(jìn)行易錯(cuò)PCR，再對此PCR片段和載體進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)單一，均為粘性末端（NEB公司內(nèi)切酶；載體和片段同步雙酶切，37度雙酶同時(shí)切2h），酶切后電泳驗(yàn)證；載體膠回收純化（此時(shí)載體已去除了待突變片段，但仍含有控制該酶其他性狀的基因）；目的片段用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化（只切掉56bp）；純化均采用捷瑞試劑盒；載體切8ug回收十幾ng/ul約20ul量；目的片段且2ug;回收約20-30ng/ul約30ul量；連接時(shí)用TakaRa 的T4 ；比例從1:3-1:10都試過；10ul-20ul化轉(zhuǎn)入商品化DH5a 都無菌落產(chǎn)生，（抗生素抗性無問題，也沒有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均無目的條帶出現(xiàn)；（菌落PCR體系無問題，以用商品化原質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取單克隆驗(yàn)證有目的條帶。） 為探究原因，做以下實(shí)驗(yàn)： 1.針對待突變部分基因做常規(guī)PCR，測序示無突變，再依上述方法酶切連接，轉(zhuǎn)化，仍未有菌落長出； 2.突變目的片段后膠回收純化，PMD-T19連接測序；刮取平板，混提質(zhì)粒，雙酶切目的片段，以之前切取純化后的目的片段對照，膠回收純化目的片段；再與雙酶切后載體T4連接，轉(zhuǎn)化商品化DH5a；仍無菌落長出；(連T載體測序示突變未導(dǎo)致酶切位點(diǎn)改變)。 另外，因相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道只突變目的片段一部分再重組,而往往是針對目的片段全長突變；不知這一點(diǎn)對分子克隆有無影響？ 可請各位專家予以指導(dǎo)，不勝感激。 |
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lywachieve
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