 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2434 | 回復(fù): 9 | |||
lywachieve至尊木蟲 (著名寫手)
|
[求助]
急 分子克隆遇到問題
|
|
目前一直在做酶分子的定向進(jìn)化，但是所做分子克隆部分三個(gè)月以來一直不成功；因?yàn)檫@是后續(xù)試驗(yàn)基礎(chǔ)，懇請大家提出寶貴建議，不勝感激； 本人是應(yīng)用易錯(cuò)PCR方法改造目的基因；即通過改變PCR體系中各組分的比例如Mg離子濃度，添加Mn離子等，模擬自然進(jìn)化引入錯(cuò)配堿基，從而改變酶的性狀。而在此之前已有公司合成載體PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已經(jīng)把目的片段全長與載體連接完成）；而導(dǎo)師的計(jì)劃是先改造目的片段的控制水解酶性狀的一部分（即目的片段部分長度）；由公司設(shè)計(jì)針對此部分片段的引物；本人進(jìn)行易錯(cuò)PCR，再對此PCR片段和載體進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)單一，均為粘性末端（NEB公司內(nèi)切酶；載體和片段同步雙酶切，37度雙酶同時(shí)切2h），酶切后電泳驗(yàn)證；載體膠回收純化（此時(shí)載體已去除了待突變片段，但仍含有控制該酶其他性狀的基因）；目的片段用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化（只切掉56bp）；純化均采用捷瑞試劑盒；載體切8ug回收十幾ng/ul約20ul量；目的片段且2ug;回收約20-30ng/ul約30ul量；連接時(shí)用TakaRa 的T4 ；比例從1:3-1:10都試過；10ul-20ul化轉(zhuǎn)入商品化DH5a 都無菌落產(chǎn)生，（抗生素抗性無問題，也沒有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均無目的條帶出現(xiàn)；（菌落PCR體系無問題，以用商品化原質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取單克隆驗(yàn)證有目的條帶。） 為探究原因，做以下實(shí)驗(yàn)： 1.針對待突變部分基因做常規(guī)PCR，測序示無突變，再依上述方法酶切連接，轉(zhuǎn)化，仍未有菌落長出； 2.突變目的片段后膠回收純化，PMD-T19連接測序；刮取平板，混提質(zhì)粒，雙酶切目的片段，以之前切取純化后的目的片段對照，膠回收純化目的片段；再與雙酶切后載體T4連接，轉(zhuǎn)化商品化DH5a；仍無菌落長出；(連T載體測序示突變未導(dǎo)致酶切位點(diǎn)改變)。 另外，因相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道只突變目的片段一部分再重組,而往往是針對目的片段全長突變；不知這一點(diǎn)對分子克隆有無影響？ 可請各位專家予以指導(dǎo)，不勝感激。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有80人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 本人目前遇到連接問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 感受態(tài)轉(zhuǎn)化及陽性克隆出現(xiàn)問題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 求助分子克隆問題——挑不出陽性克��！
已經(jīng)有14人回復(fù)
- TA克隆電擊法轉(zhuǎn)化的步驟
已經(jīng)有3人回復(fù)
- T-A克隆一直做不出來
已經(jīng)有28人回復(fù)
- 感受態(tài)細(xì)胞污染的問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 關(guān)于PBS的一個(gè)問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 基因克隆中酶切連接問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 分子克隆的經(jīng)驗(yàn)交流
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 連接轉(zhuǎn)化不成功問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 轉(zhuǎn)化克隆的問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 克隆過程出現(xiàn)的問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 分子克隆遇到了問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 分子克隆連接問題！
已經(jīng)有12人回復(fù)
- DEPC水配制及用器烘問題？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】分類鑒定的時(shí)候，為什么pcr之后還要做TA克隆，轉(zhuǎn)化，然后將序列測序呢？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】Thrombin protease切GST問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】克隆連接時(shí)間
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 【求助/交流】單酶切連接的克隆急……
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南系列之：美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典:抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南
已經(jīng)有10人回復(fù)
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 屏蔽內(nèi)容 2014-09-05 14:58:09
gyesang: 屏蔽內(nèi)容 2014-09-05 14:58:09
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
2樓2014-09-05 13:23:30
panda73
金蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 80 (初中生)
- 金幣: 1201.3
- 散金: 44
- 紅花: 2
- 帖子: 191
- 在線: 42.5小時(shí)
- 蟲號: 985964
- 注冊: 2010-03-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2014-09-05 13:24:48
lywachieve
至尊木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 14116.8
- 紅花: 1
- 帖子: 1874
- 在線: 89.3小時(shí)
- 蟲號: 2672721
- 注冊: 2013-09-22
- 性別: MM
- 專業(yè): 臨床檢驗(yàn)新技術(shù)
4樓2014-09-05 14:05:57
panda73
金蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 80 (初中生)
- 金幣: 1201.3
- 散金: 44
- 紅花: 2
- 帖子: 191
- 在線: 42.5小時(shí)
- 蟲號: 985964
- 注冊: 2010-03-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2014-09-05 22:39:27
6樓2014-09-05 22:44:41
lywachieve
至尊木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 14116.8
- 紅花: 1
- 帖子: 1874
- 在線: 89.3小時(shí)
- 蟲號: 2672721
- 注冊: 2013-09-22
- 性別: MM
- 專業(yè): 臨床檢驗(yàn)新技術(shù)
7樓2014-09-06 08:34:42
8樓2014-09-09 16:16:38
lywachieve
至尊木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 14116.8
- 紅花: 1
- 帖子: 1874
- 在線: 89.3小時(shí)
- 蟲號: 2672721
- 注冊: 2013-09-22
- 性別: MM
- 專業(yè): 臨床檢驗(yàn)新技術(shù)
9樓2014-09-09 17:01:12
10樓2014-10-30 17:04:41
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 lywachieve 的主題更新
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085700資源與環(huán)境308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-18 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +8 | llllkkkhh 2026-03-18 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑，求各位老師收留 +9 | 秋有木北 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 +5 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +8 | 戲精丹丹丹 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程調(diào)劑 +8 | 大可digkids 2026-03-16 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +9 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +5 | 煙火先于春 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | 志存高遠(yuǎn)意在機(jī)?/a> 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +3 | p asserby. 2026-03-15 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +6 | 孔志浩 2026-03-12 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自動(dòng)化所實(shí)習(xí) +6 | Losir 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +4 | 太陽花天天開心 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[基金申請]
今年的國基金是打分制嗎？
 50+3
|
zhanghaozhu 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 22408總分284求調(diào)劑 +3 | InAspic 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +3 | miaodesi 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 土木第一志愿276求調(diào)劑，科研和技能十分豐富，求新興方向的導(dǎo)師收留 +3 | 土木小天才 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
投稿問題
5+4
|
星光燦爛xt 2026-03-12 | 6/300 |
|