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lywachieve至尊木蟲 (著名寫手)
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[求助]
急 分子克隆遇到問題
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目前一直在做酶分子的定向進化，但是所做分子克隆部分三個月以來一直不成功；因為這是后續(xù)試驗基礎(chǔ)，懇請大家提出寶貴建議，不勝感激； 本人是應(yīng)用易錯PCR方法改造目的基因；即通過改變PCR體系中各組分的比例如Mg離子濃度，添加Mn離子等，模擬自然進化引入錯配堿基，從而改變酶的性狀。而在此之前已有公司合成載體PET-24a-atsA-N-6His;（即公司已經(jīng)把目的片段全長與載體連接完成）；而導(dǎo)師的計劃是先改造目的片段的控制水解酶性狀的一部分（即目的片段部分長度）；由公司設(shè)計針對此部分片段的引物；本人進行易錯PCR，再對此PCR片段和載體進行雙酶切，酶切位點單一，均為粘性末端（NEB公司內(nèi)切酶；載體和片段同步雙酶切，37度雙酶同時切2h），酶切后電泳驗證；載體膠回收純化（此時載體已去除了待突變片段，但仍含有控制該酶其他性狀的基因）；目的片段用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化（只切掉56bp）；純化均采用捷瑞試劑盒；載體切8ug回收十幾ng/ul約20ul量；目的片段且2ug;回收約20-30ng/ul約30ul量；連接時用TakaRa 的T4 ；比例從1:3-1:10都試過；10ul-20ul化轉(zhuǎn)入商品化DH5a 都無菌落產(chǎn)生，（抗生素抗性無問題，也沒有失效）；加倍T4量后有少量菌落，但菌落PCR均無目的條帶出現(xiàn)；（菌落PCR體系無問題，以用商品化原質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取單克隆驗證有目的條帶。） 為探究原因，做以下實驗： 1.針對待突變部分基因做常規(guī)PCR，測序示無突變，再依上述方法酶切連接，轉(zhuǎn)化，仍未有菌落長出； 2.突變目的片段后膠回收純化，PMD-T19連接測序；刮取平板，混提質(zhì)粒，雙酶切目的片段，以之前切取純化后的目的片段對照，膠回收純化目的片段；再與雙酶切后載體T4連接，轉(zhuǎn)化商品化DH5a；仍無菌落長出；(連T載體測序示突變未導(dǎo)致酶切位點改變)。 另外，因相關(guān)文獻鮮有報道只突變目的片段一部分再重組,而往往是針對目的片段全長突變；不知這一點對分子克隆有無影響？ 可請各位專家予以指導(dǎo)，不勝感激。 |
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gyesang: 屏蔽內(nèi)容 2014-09-05 14:58:09
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2樓2014-09-05 13:23:30
panda73
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4樓2014-09-05 14:05:57
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