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雪前金蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于SDS-PAGE出現(xiàn)的問題 已有2人參與
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我跑的是SDS-PAGE電泳，濃縮膠5%，分離膠12.5%跑質(zhì)膜蛋白，我用的是銀染的方法。上一次也是用同樣的方法試劑，蛋白質(zhì)就跑下來了，但是這一次蛋白質(zhì)樣品卡在濃縮膠與分離膠之間下不來，不知道是什么原因，請各位指點(diǎn)一下，謝謝 20140925_175807.jpg |
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金蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
2樓2014-09-27 09:22:38
3樓2015-09-26 22:23:08
【答案】應(yīng)助回帖
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1.裝板 將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度, 即可灌膠。 2. 凝膠的聚合 分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10%的分離膠和4.8%的濃縮膠。 試劑名稱 10%的分離膠/mL 4.8%的濃縮膠/mL Acr/Bis 30% 分離膠緩沖液（pH8.9） 濃縮膠緩沖液（pH6.8） 10%SDS 10%過硫酸銨 水 TEMED 5 3.75 0 0.15 0.1 5 1 1.6 0 1.25 0.1 0.1 4.95 1 按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止,約5mL。然后用細(xì)滴管或注射器仔細(xì)注入少量水,約0.5-1mL。室溫放置聚合30-40min。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子(梳子);待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。 3.蛋白質(zhì)樣品的處理 若標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lmL 0.5mol/L pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中;若樣品是液體，要測定蛋白質(zhì)濃度，按1.0～1.5mg/mL溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實(shí)驗(yàn)所用樣品為15～20mg的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶液，放置在0.5mL的離心管中，加入15—20ml的樣品處理液。在100℃水浴中處理2min，冷卻至室溫后備用。吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20ml，按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的處理方法進(jìn)行處理。 4.加樣 SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法： 用手夾住兩塊玻璃板,上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框,注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個(gè)夾緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽,插入斜板,將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上,外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可,注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。 加樣時(shí)可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準(zhǔn)確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加10～15ml(含蛋白質(zhì)10～15mg)，稀溶液可加20～30ml (還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握)。 5.電泳 加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進(jìn)膠前電流控制在15～20mA，大約15～20min;樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后，電流升到30～45mA，電泳過程保持電流穩(wěn)定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿1～2cm處即停止電泳，約1-2小時(shí)。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。 6.染色、脫色 電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25%的考馬斯亮藍(lán)染液，染色2～4h，必要時(shí)可過夜。棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進(jìn)行擴(kuò)散脫色，經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。 7.結(jié)果處理 1)測量脫色后凝膠板的長度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離)，測量指示染料遷移的距離。 2)按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率(Rm) 相對遷移率=樣品遷移距離(cm)/染料遷移距離(cm) 3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對遷移率為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上做圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 4)測定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得該蛋白質(zhì)的分子量。英格恩生物 |
4樓2015-09-29 09:49:21
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