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xulinan木蟲 (小有名氣)
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[求助]
質(zhì)粒圖譜與閱讀框問題 已有1人參與
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有兩個(gè)問題請(qǐng)教下。 1. 我們克隆基因到一個(gè)質(zhì)粒上的時(shí)候，通常引物設(shè)計(jì)是酶切位點(diǎn)+His tag（如果純化）+目的基因， 但是現(xiàn)在的問題是老師給了一個(gè)很奇怪的序列，His tag和目的基因都有，但是Histag前還多出來一些序列，并且這些堿基不是3的整數(shù)倍，他讓我用不同的酶切位點(diǎn)克隆到另一個(gè)質(zhì)粒上，我就想如果直接按他的要求直接克隆這個(gè)序列是不是翻譯的時(shí)候就框移了，因?yàn)槊黠@的His tag前面多的幾個(gè)堿基不是3的倍數(shù)啊，困惑中，又不好意思直接去找老師說他給的序列不對(duì)。請(qǐng)問這種情況是否會(huì)發(fā)生翻譯時(shí)候框移？謝謝 2. 據(jù)說如果用p413這種質(zhì)粒是不存在翻譯時(shí)框移現(xiàn)象的，請(qǐng)問這是為什么？p413圖譜見下，而且看起來這個(gè)圖譜中promoter是在XbaI一側(cè)啊，但是如果用XbaI/EcoRI這對(duì)酶切的話，會(huì)把EcoRI設(shè)計(jì)到Forword primer中，這個(gè)我又迷惑了，方向雖然看著兩頭都行，但是terminator明顯在EcoRI這側(cè)啊？EcoRI設(shè)計(jì)到Forword primer中克隆進(jìn)去的基因不就放了嗎？一直對(duì)基因復(fù)制的各種方向搞不清楚，請(qǐng)大家點(diǎn)播一二，謝謝。 413.jpg |
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通常引物設(shè)計(jì)是酶切位點(diǎn)+His tag（如果純化）+目的基因 GPD Promoters 是啟動(dòng)子。之后從ATG 開始翻譯，你只需要在你的 His tag（如果純化） 之前加上起始密碼子就沒有什么問題了。 Forword prime 位點(diǎn)應(yīng)該是XbaI |
4樓2014-09-30 11:17:47
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7樓2014-09-30 17:54:01
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非常感謝你的回復(fù)，還是有些問題： 1. 我的Hsi tag前面是有ATG的，應(yīng)該是his tag前多幾個(gè)堿基沒關(guān)系吧？按你的說法，his6前有ATG的話，前面多幾個(gè)堿基是有影響的？混亂了.... 2. Forward primer中包含的酶切位點(diǎn)應(yīng)該是靠近promoter的，比如用XbaI/EcoRI這對(duì)酶切位點(diǎn)的時(shí)候應(yīng)該是XbaI在forward primer里，但是有人用XbaI/EcoRI這對(duì)酶切位點(diǎn)的時(shí)候EcoRI在forward primer里，這樣連接不就反了嗎？還是我理解錯(cuò)誤了  |
8樓2014-09-30 18:08:24
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