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95846713新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
pet28a 空質(zhì)粒雙酶切圖像問(wèn)題 已有1人參與
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本人新手，最近做蛋白表達(dá)，前期做克隆，想先把表達(dá)載體空質(zhì)粒pet28a雙酶切 空質(zhì)粒大小5369bp，但是圖像把我搞迷糊了，希望各位高手指點(diǎn)迷津 第一張圖是第一個(gè)孔是2000Marker 當(dāng)時(shí)加錯(cuò)了 第二個(gè)孔 BamH I和EcoR I 雙酶切 pet28a 第三個(gè)是先BamH I單酶切再EcoR I單酶切 第四個(gè)是EcoR I SaL I 雙酶切 第五個(gè)是15000Marker 提pet28a質(zhì)粒濃度比較低，用的洗脫水80ul 體系10ul buffer2ul 質(zhì)粒6ul 酶各1ul 正常情況雙酶切應(yīng)該有兩個(gè)片段，我的為什么只有一個(gè) 小片段呢 ， 還有看pet28a圖譜 BamH I和EcoR I兩個(gè)酶挨著 有人說(shuō)不能切？我的圖是切下來(lái)了嗎？不然怎么會(huì)有小片段 第二張圖第一個(gè)孔15000Marker 2-7都是雙酶切就是酶用的不一樣，可惜忘記加空質(zhì)粒對(duì)照了 但是6.7buffer加錯(cuò)了BamH I和SaL I應(yīng)該加Tbuffer 我加了H buffer 好像沒(méi)切下來(lái) 看圖像比前四個(gè)高一點(diǎn) 應(yīng)該可以當(dāng)做空質(zhì)粒對(duì)照吧，是不是可以證明前四個(gè)切下來(lái)了 就是切下來(lái)的片段太小了濃度太低 看不到？ 這張圖是只有載體 沒(méi)有目的片段 我真不知道切沒(méi)切下來(lái) 體系20ul 載體8ul 酶各0.5ul buffer2ul 加 ddH2O到20ul 提空質(zhì)粒時(shí)加洗脫水80ul同樣濃度很低 綜合分析這兩個(gè)圖 體系不同 一個(gè)有小片段，一個(gè)只有質(zhì)粒 這是什么原因 怎么改進(jìn)？另外BamH I和EcoR I到底能不能切pet28a啊？ 3J%06B$}86)2SNJG~2X]HO6.jpg D79158FB275241E5AA31F57F2AEC522B.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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95846713(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-11 09:24:03
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1.你選的BamH I和EcoR I在空載上相隔8個(gè)堿基，EcoR I和 SaL I在空載上相隔20個(gè)堿基，后一對(duì)組合更容易完全酶切，前一對(duì)組合是有可能只被切一次。 2.兩對(duì)組合切下來(lái)的小片段都不能通過(guò)瓊脂糖電泳顯示出來(lái)，不明白你說(shuō)的小片段指的哪條帶？我沒(méi)有看到。 3.因?yàn)閱蚊盖信c雙酶切產(chǎn)生的大片段大小非常接近，是否完全雙酶切無(wú)法通過(guò)電泳判斷。 |
2樓2014-09-10 22:45:58
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