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求大神，蛋白質(zhì)純化過程如何解決降解和沉淀 已有4人參與
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我在His親和過程中總是出現(xiàn)蛋白降解，我該如何解決啊 還有一個(gè)蛋白，濃度稍高點(diǎn)就沉淀了，咪唑洗脫下來的就是沉淀懸浮狀了，看著這蛋白真心疼啊 大家有沒有什么好辦法，指點(diǎn)一下小弟 |
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wolfman840
木蟲 (正式寫手)
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4樓2014-10-08 14:25:39
guaihaizi
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.可以試試加入PMSF，最好是在低溫的層析冷柜里操作就更好了，或是開空調(diào)控制在22度左右也可以 2.蛋白沉淀與蛋白的性質(zhì)相關(guān)：（因素有很多的） （1）咪唑所在的緩沖體系的PH太過接近你目的蛋白的等電點(diǎn)PI，比如將PH=7.4的PB緩沖體系換成PH=8.5的Tris-HCl緩沖體系； （2）蛋白本身含過多半胱氨酸區(qū)域等致使蛋白表達(dá)過程中折疊不正確； （3）蛋白疏水區(qū)域過多，可以加入10-50%甘油； （4）緩沖體系中的NaCl的濃度也相關(guān)，可適當(dāng)降低或提高濃度。 |
2樓2014-10-08 11:23:52
3樓2014-10-08 12:18:51
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親，接近等電點(diǎn)的話，蛋白還沒與Ni柱結(jié)合就沉降了，那你還怎么純化目的蛋白��？ 拿我做實(shí)驗(yàn)的例子來說，蛋白溶解在PBS中，260mM咪唑洗脫液的成分： 500mM NaCl,50mM Tris,260mM 咪唑，用HCl調(diào)節(jié)PH=8.5； 其中PH=8.5 50mM Tris-HCl即為所謂的緩沖體系 (除咪唑和NaCl外起到調(diào)節(jié)PH作用的成分即為緩沖體系)。 如果說你用PH=8.0的依舊沉淀，可以試試PH=8.5的，其實(shí)50mM的Tris-HCl的緩沖能力在PH=8.5為最佳的說。 前提是你跑膠確認(rèn)沉淀的蛋白即為你的目的蛋白。 |
5樓2014-10-09 13:06:47
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