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[求助] Gateway構(gòu)建載體BP反應(yīng)涂平板長(zhǎng)不出單菌落已有5人參與

最近在用Gateway方法構(gòu)建載體，目的片段再300-1000bp不等，要構(gòu)建好幾個(gè)載體，同時(shí)做BP反應(yīng)后涂平板，有的能長(zhǎng)出單菌落，有的長(zhǎng)不出來(lái)，而且LR反應(yīng)正常而且轉(zhuǎn)化效率很高，長(zhǎng)不出的那幾個(gè)載體反復(fù)做了好幾次，BP酶也換過(guò)新的了，抗生素濃度也減半了，還是涂平板長(zhǎng)不出單菌落，求解！

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1樓 2014-10-22 10:22:55

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starseacow

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2014-10-23 12:33:22

1 是否使用了正確可抗性平板
2 加入BP反應(yīng)的DNA濃度是否足夠，我自己的體系是PCR產(chǎn)物1微升（大于80 ng/ul），載體1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混勻室溫3 h轉(zhuǎn)入TOP 10

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2樓2014-10-22 14:20:19

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2樓: Originally posted by starseacow at 2014-10-22 14:20:19
1 是否使用了正確可抗性平板
2 加入BP反應(yīng)的DNA濃度是否足夠，我自己的體系是PCR產(chǎn)物1微升（大于80 ng/ul），載體1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混勻室溫3 h轉(zhuǎn)入TOP 10

我是PCR產(chǎn)物150ng，載體50ng，BP 1微升，25℃過(guò)夜連接

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3樓2014-10-22 14:56:07

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大笨熊敏

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你看過(guò)Gateway構(gòu)建載體的那篇說(shuō)明書(shū)了沒(méi)有的。它上面介紹說(shuō)目的產(chǎn)物和載體大約都在150ng左右，我做BP反應(yīng)一般只反應(yīng)10h，時(shí)間太長(zhǎng)好像也會(huì)有影響。

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4樓2014-10-22 20:47:06

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4樓: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看過(guò)Gateway構(gòu)建載體的那篇說(shuō)明書(shū)了沒(méi)有的。它上面介紹說(shuō)目的產(chǎn)物和載體大約都在150ng左右，我做BP反應(yīng)一般只反應(yīng)10h，時(shí)間太長(zhǎng)好像也會(huì)有影響。

:;恩，我換一個(gè)體系試一下

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5樓2014-10-22 21:29:32

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但是我用相同的體系做LR反應(yīng)效率就很高，BP反應(yīng)就出不來(lái)

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6樓2014-10-22 21:31:02

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PCR引物設(shè)計(jì)對(duì)了沒(méi)？

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7樓2014-10-23 07:19:37

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7樓: Originally posted by sunshine436 at 2014-10-23 07:19:37
PCR引物設(shè)計(jì)對(duì)了沒(méi)？

這個(gè)應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，PCR目的條帶是對(duì)的，而且我有的載體構(gòu)建出來(lái)了，有的就構(gòu)建不出來(lái)

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8樓2014-10-23 10:00:01

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8樓: Originally posted by okletsgo at 2014-10-23 10:00:01
這個(gè)應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，PCR目的條帶是對(duì)的，而且我有的載體構(gòu)建出來(lái)了，有的就構(gòu)建不出來(lái)...

別的構(gòu)建也是做BP都成功了？用的供體載體，感受態(tài)，平板都一樣？

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9樓2014-10-23 13:05:44

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okletsgo(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-11-18 18:16:58

做BP目的基因在20~150ng之間，加載體1微升，酶1微升，TE Buffer 1微升，>=5小時(shí)，轉(zhuǎn)化后先在100微升培養(yǎng)液（不加抗生素）中擴(kuò)1小時(shí)，再凃板。

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10樓2014-10-24 23:02:46

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