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新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 生物信息學(xué)

[求助] 關(guān)于6%的尿素聚丙烯酰胺變性凝膠來(lái)跑RNA的一些問(wèn)題

由于是第一次做這個(gè)，所以都是一大堆的問(wèn)題，希望大家多多發(fā)言，謝謝。
我要建RNA測(cè)序文庫(kù)，要篩選50-500bp大小的RNA，但是考慮到要固定RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以，要用6%的尿素聚丙烯酰胺變性凝膠來(lái)跑，我用的marker是• Radiolabeled Decade and Century markers (Life Technologies)貨號(hào)：am7778，這個(gè)marker，loading buffer是marker中帶的，現(xiàn)在問(wèn)題如下：
1.這個(gè)凝膠的配方是什么，是我們平時(shí)的蛋白膠的配方嗎？就是水，30%丙烯酰胺，tris，sds，過(guò)硫酸銨，temed？是只有分離膠，沒(méi)有濃縮膠哈？
2.電泳緩沖液的配方是什么，是我們平時(shí)跑蛋白的時(shí)候，用的tbe（tris，甘氨酸，edta）嗎？還是有什么新的配方。
3.試驗(yàn)中需要注意些什么？比如說(shuō)，電泳的時(shí)候，電泳buffer中需要加些什么東西嗎？比如甲酰胺或者尿素，還有聽說(shuō)在上樣的時(shí)候要吹上樣孔？就是用電泳buffer反復(fù)清洗上樣孔嗎？
4.試驗(yàn)中都要保證是RNase free環(huán)境嗎?怎么保證？
5.染膠用eb就可以嘛？切膠再在外線切膠臺(tái)就ok？拍照的話，就是在紫外曝光儀中就可以嘛？
6.上樣的時(shí)候loading buffer中還要加其他東西嗎？像甲酰胺或者尿素之類的。
7.還有就是甲酰胺或者尿素這個(gè)東西在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中要用到嘛？在哪一步用到？
問(wèn)題就這么多？請(qǐng)大家踴躍發(fā)言，多謝多謝！

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1樓 2014-10-23 13:33:49

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zuohuaangel

銅蟲 (小有名氣)

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我做過(guò)DNA的你現(xiàn)在問(wèn)題還需要答復(fù)嗎

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回復(fù)此樓

2樓2015-08-07 14:31:57

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