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[求助]
易錯(cuò)PCR酶切與連接 已有8人參與
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做了大半年的易錯(cuò)PCR，但酶切連接后轉(zhuǎn)化子很少，求助�。。� 我的基因?yàn)?700bp，質(zhì)粒為pET-28（a），酶切位點(diǎn)為BamH I與Xhol，F(xiàn)D、NEB的內(nèi)切酶都試過(guò)，效果都不好，請(qǐng)各位大俠賜教。 |
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huangrui1988 
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neer(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-11-01 19:26:14
neer(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-11-01 19:26:14
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你把你的突變片擴(kuò)大不就可以了嗎。 你首先構(gòu)建一個(gè)野生型的基因在質(zhì)粒上面的，然后往這個(gè)基因的上下游各自100bp設(shè)計(jì)引物就可以了。這樣的話，你擴(kuò)出來(lái)的片段就會(huì)使前面100bp+你的基因片段+后面100bp，經(jīng)過(guò)酶切就可以得到你要的基因片段了。這樣做的好處就是你可以避免酶切位點(diǎn)的突變錯(cuò)誤，易錯(cuò)PCR一開(kāi)始的位點(diǎn)很奇葩，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)酶切失敗的情況。 |
8樓2014-10-31 23:47:22
2樓2014-10-31 10:42:34
huangrui1988
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3樓2014-10-31 10:55:54
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4樓2014-10-31 13:45:33
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