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[交流] 請(qǐng)教一個(gè)PCR產(chǎn)物直接酶切的問題

本人最近做PCR產(chǎn)物直接酶切來驗(yàn)證某個(gè)基因SNP的差異，野生型中含有可以酶切的一個(gè)位點(diǎn)，突變型中不含有酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)用全式金的Eco Taq Mix擴(kuò)增的，片段大小為859bp，見附圖中的1,2，3，9,10泳道，限制性內(nèi)切酶用的不常用的Hpy99I(NEB),PCR產(chǎn)物沒有過柱回收，連續(xù)做了好幾次，用野生型的PCR產(chǎn)物酶切后均沒有任何條帶，今天酶切條件是25uL體系，2U酶，加了BSA,以第10泳道的PCR產(chǎn)物5uL作為模板酶切（昨天分別做了10uL和15uL的模板濃度，均無酶切條帶，所以推測不是模板濃度的問題），酶切結(jié)果在第十一泳道，什么條帶都沒有。
另外，由于該P(yáng)CR產(chǎn)物中有單一的HindIII酶切位點(diǎn)，因此選擇HindIII作為陽性對(duì)照，做了平行的酶切反應(yīng)，酶切結(jié)果見泳道4-8.
請(qǐng)問導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是什么，謝謝。

PCR產(chǎn)物酶切.jpg

[ Last edited by barrey on 2012-9-3 at 07:38 ]

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1樓 2012-08-28 17:28:35

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wizardfan: 金幣+3, 很詳細(xì)的回答 2012-08-29 05:24:01

第一、marker 多大？
第二、上樣量多大？
第三、酶切之后的兩條帶都是多大？
第四、這個(gè)的不常用的Hpy99II (NEB）酶切效率怎樣？與常見的HindIII相比。
第五、可以嘗試一下柱回收。
~~~~

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2樓2012-08-28 20:42:21

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10樓2012-08-29 06:23:20

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yqbter: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖！ 2012-09-03 13:20:29

1. 你用的是Hpy99II 還是Hpy99I ？
2. 酶切突變型的PCR產(chǎn)物也是同樣會(huì)把產(chǎn)物降解了嗎？
3. 酶切帶有這個(gè)位點(diǎn)的質(zhì)粒，效果如何？是否可以保證這個(gè)酶沒被污染？
4. 嘗試回收純化PCR產(chǎn)物切一次，如果效果相同，那可能真的是酶的問題。

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16樓2012-08-29 08:52:28

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阿牧

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yqbter: 金幣+2, 不錯(cuò)的回答！ 2012-08-29 17:45:16

第一個(gè)問題：第11泳道完全沒有條帶，即使沒有切開也不應(yīng)看不到條帶，是否酶切底物太少？（該問題很重要）
以下僅供參考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR過程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好認(rèn)真研究下該酶的特性(限制性位點(diǎn)、最適溫度等)
3、最好純化下PCR產(chǎn)物，否則會(huì)影響酶的效率

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17樓2012-08-29 08:59:18

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如果是活力不高的酶，pcr產(chǎn)物應(yīng)該純化捏

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20樓2012-08-30 08:35:02

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constra

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看天: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-01 06:56:56

NEB網(wǎng)站上找不到Hpy99II阿，只有Hpy99I，是不是酶搞錯(cuò)了。當(dāng)然這個(gè)不能解決樓主的問題，看樓主的膠，直接想到的可能就是DNase污染，當(dāng)然還有個(gè)不太可能的原因，看樓主的膠，邊緣發(fā)黑，是不是照相的時(shí)候邊緣沒有在紫光燈的范圍里？肉眼觀察也什么都看不到么？

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21樓2012-08-31 21:45:31

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yaoshu210

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22樓2012-08-31 21:57:32

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引用回帖:

17樓: Originally posted by 阿牧 at 2012-08-29 08:59:18
第一個(gè)問題：第11泳道完全沒有條帶，即使沒有切開也不應(yīng)看不到條帶，是否酶切底物太少？（該問題很重要）
以下僅供參考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR過程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好認(rèn)真研究下 ...

重復(fù)做了一下實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)是酶切底物濃度太低，但是正常酶切后的條帶濃度仍很低。

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26樓2012-09-03 07:37:49

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鳳凰-涅磐

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