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終朝采露新蟲 (初入文壇)
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[求助]
NI柱純化，雜質(zhì)揮之不去 已有1人參與
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各位大師，不多說，先謝謝，直接上主題： GE 1mlHis trap預(yù)裝柱，第二次使用。akta系統(tǒng) wash buffer 含0.5M Nacl 10mM 咪唑，ph 7.4. elution buffer 0.5M Nacl 500mM 咪唑，ph 7.4. 蛋白為大腸桿菌表達(dá)可溶蛋白，破碎后離心上清上樣（問題 1. 直接用 wash buffer 重懸菌體后破碎是否可以？是否需要加一些detergent或PMSF。） 流速0.5ml/min 左右。 洗脫問題來了，各組分收集后 sds-page電泳如圖，目的蛋白在32kd左右，雜蛋白太多了，感覺完全沒有分離的效果。（問題2，每個(gè)梯度收集量多大比較合適？比如5%梯度紫外拖尾下降的很慢，是否需要等紫外降到一個(gè)水平值，再開啟10%？這次收集各梯度之間的洗雜沒有很充分，是否是這個(gè)原因？本人都手動(dòng)梯度洗脫） 問題3。后續(xù)純化該如何改進(jìn)？目的 純度優(yōu)先，產(chǎn)量第二。在不用離子和凝膠柱的前提下，這個(gè)Ni柱是否不適合該蛋白。 問題4. 我的電泳膠下面1-2cm感覺下不去是什么原因？每次跑完都和上面的顏色不一樣，分離膠15%濃度 實(shí)驗(yàn)新手，誠心向各位討教，請知無不言。謝謝！ 第一次發(fā)帖，發(fā)現(xiàn)金幣不夠。真想把問題一次寫出來，先說下我的感受，據(jù)上面說該蛋白his標(biāo)簽在N端和C端都有，做過ELISA，有顯色反應(yīng)。但純化感覺就是蛋白和雜蛋白一起掛在柱子上，目的蛋白和雜蛋白一起洗脫，梯度難分開。 37548100.jpg |
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lijing1212
禁蟲 (初入文壇)
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
3樓2015-01-21 11:09:54
2樓2014-11-12 17:26:27
4樓2015-01-21 14:55:21
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