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[求助]
細(xì)菌的分子鑒定
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各位蟲(chóng)友: 大家好，本人在做細(xì)菌的分子鑒定時(shí)，出現(xiàn)了些故障。每次細(xì)菌DNA提取完后，進(jìn)行PCR，再送出去測(cè)序，要測(cè)的片段是750bp左右，但測(cè)序結(jié)果始終從500bp以后都有雙峰，我也改變了退火溫度，但效果不明顯。能確保是單一菌落提DNA，除了連梯載，還有什么辦法嗎？請(qǐng)各位指點(diǎn)指點(diǎn)，在此謝過(guò)了。 PCR引物：1405f（5'-TGYACACACCGCCCGT-3'） 456r（5'-CCTTT CCCTCACGGTACTG -3'） 程序：94度，5min 94度，1min 61度，1min 72度，90s 72度，10min bw988h2502922_1409724304_617.jpg bw988h2502922_1409724304_617.jpg |
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至尊木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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miao2010: 金幣+45, 博學(xué)EPI+1 2014-12-09 11:55:20
miao2010: 金幣+45, 博學(xué)EPI+1 2014-12-09 11:55:20
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你PCR引物命名為什么大序號(hào)用f(forward)，小序號(hào)用r(reverse)呢？ 測(cè)序只用了正向引物么？可以用反向引物測(cè)序，應(yīng)該500bp后面的信號(hào)會(huì)比較清楚。 如果想用單引物測(cè)通，可以提高PCR產(chǎn)物的濃度。比如增加PCR反應(yīng)體積或者增加一管PCR反應(yīng)，產(chǎn)物濃縮后的體積不變。 |
2樓2014-12-06 18:45:47
3樓2014-12-09 11:58:37
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