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植物功能基因?qū)嶒炘O(shè)計
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最近要做單子葉藥用植物的功能基因，剛?cè)腴T，還有很多不了解的，在此求教。 1、想一次克隆多個基因，是以隨機引物Oligo（dT）逆轉(zhuǎn)錄cDNA，之后各自進行擴增；還是分別設(shè)計接頭引物結(jié)合Oligo（dT）以mRNA為模板進行3’，5‘端的RACE。逆轉(zhuǎn)錄Promega的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶10,000 U報價188，是否要自己訂購Oligo（dT）Primer和dNTP和RAnase，GoScript逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)報價699，寶生最近主頁上不去，逆轉(zhuǎn)錄酶報價沒找到。。。 2、利用簡并引物法設(shè)計引物（用Codehop設(shè)計的，不知道選擇的引物適不適合），結(jié)合巢式PCR，得到一段較保守的的序列，直接連接T載體。寶生的pMD18-T，報價500，Promega的pGEM-T報價350，查說pMD18轉(zhuǎn)化率高，不用做藍白斑篩選，酶切之后可以作為pUC使用（？）; pGEM-T據(jù)說效果也不錯，不知道作為T載體使用之后能不能繼續(xù)利用。 3、用RACE得到全長，查說3'端不需要試劑盒，5‘端比較困難。試劑盒用哪家的性價比高呢？ 4、得到全長之后，驗證蛋白（酶）的功能，只需要轉(zhuǎn)到酵母中去表達吧，是要分泌蛋白還是不分泌呢，這關(guān)系到載體的選擇，目前還不太了解。 5、考慮之后要不要做發(fā)狀根誘導轉(zhuǎn)化目的基因進行功能驗證，但是單子葉的誘導一般認為比較困難，目前我所知道的只有玉米（據(jù)說也有鴨跖草科的植物成功過），我想試一試，問隔壁實驗室要了發(fā)根農(nóng)桿菌C58c1，打算參照玉米的誘導條件試試，也想用其他的發(fā)狀根農(nóng)桿菌菌種誘導，但是覺得購買菌種不合算，老師不會贊成的，所以最好可以低價從蟲友那里買幾種，若有不吝贈送的當然更加感激！（如果有蟲友覺得單子葉植物的發(fā)狀根誘導毫無可能，也可以有理有據(jù)地潑潑冷水，我看是不是就不做了，只在其他模式植物里進行功能驗證。） 本人在南京，問題較多，希望有蟲友站短聯(lián)系~ |
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2樓2014-12-16 09:57:00
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3樓2016-07-01 18:37:30
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