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植物功能基因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)
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最近要做單子葉藥用植物的功能基因，剛?cè)腴T，還有很多不了解的，在此求教。 1、想一次克隆多個(gè)基因，是以隨機(jī)引物Oligo（dT）逆轉(zhuǎn)錄cDNA，之后各自進(jìn)行擴(kuò)增；還是分別設(shè)計(jì)接頭引物結(jié)合Oligo（dT）以mRNA為模板進(jìn)行3’，5‘端的RACE。逆轉(zhuǎn)錄Promega的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶10,000 U報(bào)價(jià)188，是否要自己訂購(gòu)Oligo（dT）Primer和dNTP和RAnase，GoScript逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)報(bào)價(jià)699，寶生最近主頁(yè)上不去，逆轉(zhuǎn)錄酶報(bào)價(jià)沒(méi)找到。。。 2、利用簡(jiǎn)并引物法設(shè)計(jì)引物（用Codehop設(shè)計(jì)的，不知道選擇的引物適不適合），結(jié)合巢式PCR，得到一段較保守的的序列，直接連接T載體。寶生的pMD18-T，報(bào)價(jià)500，Promega的pGEM-T報(bào)價(jià)350，查說(shuō)pMD18轉(zhuǎn)化率高，不用做藍(lán)白斑篩選，酶切之后可以作為pUC使用（？）; pGEM-T據(jù)說(shuō)效果也不錯(cuò)，不知道作為T載體使用之后能不能繼續(xù)利用。 3、用RACE得到全長(zhǎng)，查說(shuō)3'端不需要試劑盒，5‘端比較困難。試劑盒用哪家的性價(jià)比高呢？ 4、得到全長(zhǎng)之后，驗(yàn)證蛋白（酶）的功能，只需要轉(zhuǎn)到酵母中去表達(dá)吧，是要分泌蛋白還是不分泌呢，這關(guān)系到載體的選擇，目前還不太了解。 5、考慮之后要不要做發(fā)狀根誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，但是單子葉的誘導(dǎo)一般認(rèn)為比較困難，目前我所知道的只有玉米（據(jù)說(shuō)也有鴨跖草科的植物成功過(guò)），我想試一試，問(wèn)隔壁實(shí)驗(yàn)室要了發(fā)根農(nóng)桿菌C58c1，打算參照玉米的誘導(dǎo)條件試試，也想用其他的發(fā)狀根農(nóng)桿菌菌種誘導(dǎo)，但是覺(jué)得購(gòu)買菌種不合算，老師不會(huì)贊成的，所以最好可以低價(jià)從蟲友那里買幾種，若有不吝贈(zèng)送的當(dāng)然更加感激�。ㄈ绻邢x友覺(jué)得單子葉植物的發(fā)狀根誘導(dǎo)毫無(wú)可能，也可以有理有據(jù)地潑潑冷水，我看是不是就不做了，只在其他模式植物里進(jìn)行功能驗(yàn)證。） 本人在南京，問(wèn)題較多，希望有蟲友站短聯(lián)系~ |
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2樓2014-12-16 09:57:00
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3樓2016-07-01 18:37:30
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