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蘇梓慕2011新蟲 (初入文壇)
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[求助]
克隆測序結(jié)果分析，急急 已有3人參與
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| 剛開始做PCR和克隆，要測功能基因，目的條帶大概300，用純菌做的，直接送PCR產(chǎn)物測序，測出來結(jié)果是目的基因，然后老師讓克隆，不知為什么，老師沒讓純化，直接沒切條帶直接做了克隆，做完送去測序，是用PCR引物測得，結(jié)果出來估計不好，因為我還不知道怎么看克隆測序結(jié)果，然后老師又讓用載體引物送去測序，現(xiàn)在結(jié)果出來了，我想問下這個實驗中間是不是有什么不妥，會造成結(jié)果不對，還有就是測序結(jié)果到底怎么看？用PCR引物測序和用載體引物測序，結(jié)果究竟有什么不同？怎么分析能看出來是不是有我要的目的基因？求解答�。ㄎ医饚盘倮玻慷加蒙侠玻� |
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xdd1029
銅蟲 (初入文壇)
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2樓2014-12-19 20:36:26
hajierlove
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3樓2014-12-19 20:36:26
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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質(zhì)粒克隆用PCR引物測序是錯誤的。第一，PCR片段全部序列必須測通，否則也許會漏掉隨機突變，如果用引物PCR，至少引物和隨后的十幾個堿基是測不準的。第二，PCR片段插入有時會發(fā)生倒插現(xiàn)象，這個必須用載體引物才看得出來。 “不知為什么，老師沒讓純化，直接沒切條帶直接做了克隆”是部分PCR產(chǎn)物電泳后純化測序正確，所以老師讓你拿剩余的PCR產(chǎn)物直接連載體了么？這樣是可以的。因為電泳純化會損失一部分PCR產(chǎn)物。這樣直接連成功率更高。而PCR反應(yīng)體系中的引物和模板DNA不會參與連接的。 測序結(jié)果中不同顏色的峰分別代表ATCG，按順序讀就好，其實在每個峰的上部都有標明ATCG的，自己最好從頭至尾讀一遍，有的時候重疊峰或峰值低，機器容易誤讀。PCR產(chǎn)物的序列應(yīng)該是已知的吧，可以去NCBI的blast和測序結(jié)果做比對。 |
4樓2014-12-19 21:35:20
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