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dazhen9527新蟲 (小有名氣)
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[交流]
蛋白純化有雜帶 已有2人參與
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目的蛋白83KDa，C端his標(biāo)簽，鎳柱純化過(guò)程中，總是在37KDa處伴隨一條很亮的雜帶，用的BL21表達(dá)菌株，pET28a表達(dá)載體！請(qǐng)大家多指教！ 6C141788A91EED14BE05267F995EC824.jpg |
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董博士
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
dazhen9527: 金幣+10 2014-12-29 16:06:51
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
dazhen9527: 金幣+10 2014-12-29 16:06:51
| 這個(gè)之前我也遇到過(guò)，我后來(lái)重新用異丙醇以及酒精清洗了柱子，重新?lián)u了菌，并在誘導(dǎo)條件方面控制都很嚴(yán)格，然后10ul上樣，1RPM過(guò)柱，再用50nM咪唑清洗，6RPM， 之前就是數(shù)值一直不變，這次數(shù)值變化很大，先增后降，直到穩(wěn)定，然后400nM洗脫，2RPM，后來(lái)跑電泳，結(jié)果非常好。樓主可以嘗試。 |
7樓2014-12-28 21:49:17
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2樓2014-12-25 20:40:43
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3樓2014-12-25 22:14:43
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4樓2014-12-26 09:04:57
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8樓2014-12-29 16:08:41
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
dazhen9527: 金幣+10, 謝謝，這是一種好建議 2014-12-30 08:30:04
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
dazhen9527: 金幣+10, 謝謝，這是一種好建議 2014-12-30 08:30:04
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想了解一下出現(xiàn)這種原因，是因?yàn)楸坏鞍酌盖懈盍�，還是雜蛋白沒去除干凈。 只要從膠上把感興趣的蛋白質(zhì)帶回收，然后測(cè)定一下N末端的10左右的氨基酸就可以確定；或者用肽譜分析——用胰蛋白酶分別切割原始蛋白質(zhì)和雜帶蛋白質(zhì)，對(duì)比后者的裂解出的肽段斑是否包括在前者的肽段斑，不過(guò)可能有風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榭赡芙到夂蟮牡鞍踪|(zhì)可能顯露出新的酶切位點(diǎn)。也可以酶切后用質(zhì)譜，對(duì)比原始蛋白質(zhì)和雜帶，但是至少對(duì)于雜帶蛋白質(zhì)進(jìn)行局部測(cè)序是必要的，因?yàn)槟悴⒉淮_定雜蛋白具體有哪些。 |
9樓2014-12-30 00:42:04
10樓2014-12-30 16:27:24
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