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如何通過RNA-Seq了解轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)
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測序轉(zhuǎn)錄組的方法可不止一種。一些研究人員的目標(biāo)是計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)錄本，評估表達(dá)水平，則測序可代替DNA芯片。而另一些研究人員感興趣的是轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。大家都知道，真核生物的基因常常經(jīng)過選擇性剪接。是否包含特定的外顯子，這有著深遠(yuǎn)的生物學(xué)影響。 前一個應(yīng)用比較簡單，也更加廣泛。它與Illumina測序平臺的特征相吻合，這些平臺提供了短的RNA序列，但每次有數(shù)十億個。而對于后一個陣營的研究人員而言，生物信息學(xué)工具和長讀取計(jì)數(shù)才是問題的關(guān)鍵。 長長短短的讀取 據(jù)Pacific Biosciences的首席科學(xué)官Jonas Korlach介紹，哺乳動物的轉(zhuǎn)錄本大約在1,000至3,000個堿基，并以多種形式存在。例如，一個基因有5個外顯子，則可能出現(xiàn)各種配置，如12345、1245、1345、245等等。弄清這些不同形式的結(jié)構(gòu)和豐度應(yīng)該不是什么難事，只要測序每個RNA分子并計(jì)算其數(shù)量。然而，問題在于目前的測序技術(shù)無法做到這一點(diǎn)。 Illumina的HiSeq v4試劑每次運(yùn)行大約產(chǎn)生40億個高度準(zhǔn)確的讀取，這對轉(zhuǎn)錄組測序而言是足夠了。然而，每個雙端讀取的長度在2 x 125 bp，這就難以確定哪些片段是在一起的。如果這些讀取中包含重復(fù)元件，則很難定位到基因組中。 斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)教授Michael Snyder在接受采訪時表示：“你仔細(xì)想想，我們研究轉(zhuǎn)錄組的方式是瘋狂的。我們得到RNA，將其炸成碎片，然后又嘗試將它們組合回去，了解轉(zhuǎn)錄組一開始是個什么樣子。這是一種可怕的方式�！� Pacific Biosciences的單分子測序系統(tǒng)PacBio RS II產(chǎn)生了平均長度在8,500 bp的讀取，這足以覆蓋大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本。但RS II的每個SMRT Cell只產(chǎn)生50,000至80,000個讀取，這對于全面讀取每個轉(zhuǎn)錄本而言還是太少。 混合方法 對于許多研究人員來說，兩全的解決方案就是將兩種方法相結(jié)合。在最近一項(xiàng)發(fā)表于PNAS上的研究中，Snyder的研究團(tuán)隊(duì)采用混合策略，利用PacBio的長讀取和Illumina的短數(shù)據(jù)來測序一位兒童及其父母的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。同時，Illumina的讀取也能用來檢查PacBio堿基檢出的錯誤[1]。 華盛頓大學(xué)西北基因組中心的技術(shù)開發(fā)主任Jason Underwood也在H1人胚胎干細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組分析中采用了這種策略[2]。他們的“混合測序（hybrid sequencing）”方法鑒定出H1細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)百個新基因/長鏈非編碼RNA（lncRNA）以及數(shù)千個已知基因的異構(gòu)體。 不過，Underwood并不總是利用短讀取來進(jìn)行錯誤校正，在分析雞的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)時，他只使用了長讀取技術(shù)[3]。他利用SMRT測序來產(chǎn)生雞胚胎心臟的全長cDNA，鑒定出9,000多個新穎的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，以及Ensembl注釋中未包含的500多個基因。 據(jù)Korlach介紹，PacBio的技術(shù)讓研究人員能捕獲全部的轉(zhuǎn)錄本多樣性。在這種稱為Iso-Seq的方法中，用戶合成cDNA并篩分，創(chuàng)建出不同長度的文庫，然后環(huán)化并測序。PacBio的SMRT分析軟件對相同結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類，從而最大限度減少測序錯誤�；パa(bǔ)的策略是環(huán)化測序（circular consensus sequencing，CCS），其中cDNA被環(huán)化并反復(fù)測序，以產(chǎn)生更加準(zhǔn)確的平均讀取。 鑒于PacBio的讀取次數(shù)相對較低，一些研究人員將這種技術(shù)與選擇一些基因的方法相結(jié)合。在一項(xiàng)最新的研究中，瑞士巴塞爾大學(xué)Peter Scheiffele領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)利用PacBio方法，對成年小鼠大腦中的370,000個軸突蛋白轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，鑒定出這個家族中近1,400個獨(dú)特的異構(gòu)體[4]。 分析工具 為了理解那些數(shù)據(jù)，Scheiffele的團(tuán)隊(duì)使用了一種稱為GMAP的算法程序，這也是Underwood使用的。分析轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的其他生物信息學(xué)工具包括Cufflinks、SpliceMap和 SigFuge。SigFuge由北卡羅來納大學(xué)教堂山分校D. Neil Hayes副教授的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，是一種鑒定有趣的結(jié)構(gòu)變異的工具。Hayes則使用它來鑒定數(shù)千個患者樣本中的癌癥標(biāo)志物�！叭绻儺惡苤匾敲此鼞�(yīng)當(dāng)是經(jīng)常性的，”他解釋道。有了SigFuge，“我們能夠檢測RNA結(jié)構(gòu)中經(jīng)常性的結(jié)構(gòu)變異�！� 但是你需要多少序列才能找到它們呢？Hayes認(rèn)為沒有簡單的答案�！耙话銇碚f，越多越好。但是你測序越多，研究就越昂貴�！彼J(rèn)為每個腫瘤轉(zhuǎn)錄組需要6000萬個Illumina讀取。 作為一般準(zhǔn)則，Underwood建議對全轉(zhuǎn)錄組分析感興趣的用戶至少分析每個樣品的100萬個讀取�！白畹秃妥罡弑磉_(dá)的RNA之間可能相差5至6個數(shù)量級，”他說。因此，即使是最稀有的轉(zhuǎn)錄本，100萬個讀取應(yīng)該也夠了。這大約需要PacBio儀器上的20個SMRT cell，或每次運(yùn)行8個cell，2.5次運(yùn)行。（Jeffrey M. Perkel ） 參考文獻(xiàn) [1] Tilgner, H, et al., “Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome,” Proc Natl Acad Sci USA, 111:9869-74, 2014. [PubMed ID: 24961374] [2] Au, KF, et al., “Characterization of the human ESC transcriptome by hybrid sequencing,” Proc Natl Acad Sci USA, 110:E4821–30, published online November 26, 2013, doi: 10.1073/pnas.1320101110. [PubMed ID: 24282307] [3] Thomas, S, et al., “Long-read sequencing of chicken transcripts and identification of new transcript isoforms,” PLoS ONE, 9:e94650, 2014. [PubMed ID: 24736250] [4] Schreiner, D, et al., “Targeted combinatorial alternative splicing generates brain region-specific repertoires of neurexins,” Neuron, in press, 2014. [DOI: 10.1016/j.neuron.2014.09.011] |
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3樓2014-12-26 16:58:58
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2樓2014-12-26 15:51:52
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