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95846713新蟲 (初入文壇)
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[求助]
pet28a 和pet32a 連接701bp的目的片段后跑電泳圖有雜帶 ，求分析 已有1人參與
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將pet28a和pet32a空質(zhì)粒與目的條帶用相同的酶雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化至DH5α中，菌液PCR有條帶，提質(zhì)粒后已送測(cè)序，等待結(jié)果中，將質(zhì)粒又轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）中，挑8個(gè)單克隆做菌液PCR有條帶，很亮，再?gòu)腂L21中提質(zhì)粒pet28a-701， pet32a-701 跑電泳發(fā)現(xiàn)有雜帶，而之前從DH5α中提質(zhì)粒未見(jiàn)雜帶，在BL21中提質(zhì)粒跑電泳卻又雜帶， pet28a 空質(zhì)粒5369bp，pet32a空質(zhì)粒5900bp 目的條帶701bp ，第一個(gè)圖如圖 lane1：15000marker 從上至下為15000,10000,7500，5000,2500,1000,250 bp； Lane2 ：pet28a 空質(zhì)粒；Lane3：pet28a-701；Lane4：pet32a-701；Lane5：pet28a-701；Lane：pet32a-701；Lane：pet28a-701；Lane8： pet32a-701 Lane 3-8為挑的不同的單菌落， 我問(wèn)了一個(gè)博士，他說(shuō)連接過(guò)程中可以是多種的構(gòu)象，有雜帶是正常的，Lane 3-8 每個(gè)Lane有三個(gè)條帶，最小的條帶是最符合的，但其他兩條條帶是排列構(gòu)象不同而已，可以認(rèn)為都連接上了，我要做做雙酶切的圖，把701bp目的片段切下來(lái)，他說(shuō)雙酶切后條帶就都一樣了，這種說(shuō)法合理嗎？我就納悶為什么在DH5α中提出來(lái)的重組質(zhì)粒卻沒(méi)有雜帶呢？難道是污染了？ C7G1TCW[SF58G(2C}J`[8EV.png 第二個(gè)圖 Lane1 15000marker；Lane2：從DH5α中提質(zhì)粒Pet28a-701； Lane3 ：pet28a 空質(zhì)粒；Lane4：從DH5α中提質(zhì)粒Pet32a-701；Lane5：pet32a空質(zhì)粒；Lane6:1Kb Ladder marker UWXKV~715_{QEY(]MYZ(5FV.jpg 第三個(gè)圖將pet28a-701和pet32a-701重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21后做的菌液PCR Lane1：2000marker；Lane2-5菌液PCR正確701bp（含有pet28a-701菌液中），Lane6：沒(méi)加樣；Lane：7-10 均為菌液PCR正確701bp（含有pet32a-701菌液中） )2N@DJIE$S2X0O@N{9L@]0E.jpg |
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781055707
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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95846713: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2015-01-09 12:33:19
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95846713: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2015-01-09 12:33:19
BL21（DE3）是蛋白表達(dá)型菌株，和DH5A不能比的，BL21（DE3）在用堿提法時(shí)我就常是兩條帶。樓主有三條帶，最下面的是質(zhì)粒雙鏈斷裂，線性化的質(zhì)粒才和你的空載差不多，第二條是質(zhì)粒單鏈斷裂，第三條是環(huán)狀質(zhì)粒。你的博士朋友說(shuō)的很對(duì)，它們都是一個(gè)質(zhì)粒，被酶切以后，就線性化了，條帶當(dāng)然就一樣了。樓主有PET28A,32A的空載的話，我們以后可以交換這些實(shí)驗(yàn)試劑呀 不過(guò)樓主的空載跑到了4500，換個(gè)marker 試試吧。 |
2樓2015-01-06 11:39:23
95846713
新蟲 (初入文壇)
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3樓2015-01-06 20:32:50
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你好 我想問(wèn)一下 我的是pet21載體連接的目的片段 都用然后用的DH5a感受態(tài)細(xì)胞 然后提出來(lái)的質(zhì)粒 然后用雙酶切鑒定 后發(fā)現(xiàn) 兩條帶一條5000一條3000bp 但是我的目的條帶應(yīng)該是600 但是沒(méi)有帶 是不是不對(duì)呀 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2016-01-04 16:12:49
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