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提取植物RNA時槍頭等需不需要用DEPC水處理 已有1人參與
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準(zhǔn)備研究經(jīng)過染毒處理后的植物葉片中某種酶基因表達(dá)量的變化，打算這樣做：先提取新鮮植物材料（蠶豆）葉片中的RNA，然后反轉(zhuǎn)錄cDNA，再去熒光定量。由于沒做過這方面實(shí)驗(yàn)，好多不懂的地方，想請教一下高手一些問題。 1. 提RNA前所有的耗材怎么處理呀，新鮮的植物組織是不是必須用液氮研磨？用到的槍頭離心管到底需不需要用0.1%DEPC水處理？DEPC好像吸入毒性挺大的還致癌什么的怪嚇人。。。用到的玻璃器皿也需要DEPC水浸泡嗎？我提RNA用的是試劑盒，上面注意事項上只說：玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底沖洗后高壓滅菌。沒提到DEPC處理的事。 2. 因?yàn)槲覄傋雠绿岬腞NA質(zhì)量不好不敢反轉(zhuǎn)錄，所以想先跑下電泳看看。我是這么做的把提取的RNA樣品取10μl, 用RNase-Free Water（試劑盒自帶）稀釋到100μl,其余先放入-20冰箱，我想問上樣的時候加多少μl的RNA樣品和多少μl的loding buffer好？這個loding buffer用跑DNA電泳的可以嗎？電泳緩沖液用1*TAE可以嗎，需要DEPC處理嗎？ |
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sicilia189
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a71840584(q317476148代發(fā)): 金幣+2 2015-01-15 18:24:26
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a71840584: 金幣+3, ★★★很有幫助 2015-01-16 11:30:17
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1 植物組織需用液氮研磨，因要保持低溫；槍頭、離心管等不需DEPC處理，120℃高溫滅菌40分鐘，60℃烘干即可，但最好分出專門用于RNA操作的槍頭、離心管，不與DNA耗材混用； 2 RNA稀釋后，上樣時加0.5-1μg左右即可，樣品量過多易過載，loding buffer按DNA用量即可，loding buffer和電泳用品最好DNA、RNA區(qū)分開，但用法和用量相同。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
3樓2015-01-15 00:00:13
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q317476148: 金幣+3 2015-01-15 18:24:14
q317476148: 金幣+3 2015-01-15 18:24:14
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好像很久沒見你發(fā)帖了，實(shí)驗(yàn)進(jìn)展如何？ 1 植物組織最好液氮研磨。所有實(shí)驗(yàn)器具需要DEPC處理，不過不用太擔(dān)心，注意保護(hù)自己就好。槍頭如果買進(jìn)口的無RNase污染的，可以直接用，國產(chǎn)的還是DEPC處理一下比較放心。我的經(jīng)驗(yàn)，不太注意的話，RNA很可能降解。試劑盒上寫的方法可以試試，不過我自己傾向于用DEPC。 2 Loading buffer的使用參考其具體說明書。單純看提取RNA質(zhì)量，認(rèn)真清洗好電泳槽，使用新配置的TAE和膠，不需要DEPC處理。 |
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a718405842樓2015-01-14 17:31:41
4樓2015-01-15 15:56:58
5樓2015-01-15 16:02:04
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