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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 關于 提取巨噬細胞蛋白問題
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searush銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
關于 提取巨噬細胞蛋白問題 已有2人參與
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請問下怎么提取巨噬細胞蛋白做WB，我之前是六孔板各加250微升的RIPA，濃度測定為2-4 ug/ul。請問這樣做WB可以嗎？還有裂解液用RIPA合適嗎，還是有專門的細胞蛋白裂解液嗎？ 請指教 |
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searush
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2樓2015-01-22 11:18:53
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5樓2015-05-04 16:46:07
【答案】應助回帖
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我最近也在從巨噬細胞中提取蛋白，但是濃度遠比樓主的低，不知道樓主是怎么做到的，方便說一下么。 我先說說我是怎么做的： 先是鋪板后給藥，提蛋白前細胞已經(jīng)特別密集的分布到六孔板中有些甚至疊起來。 1.細胞用培養(yǎng)基吹打下來，收集細胞懸液1000rpm離心5分鐘。 2.用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次洗滌后盡可能吸干上清。 3.每孔加入150μl RIPA裂解液（臨用前加入PMSF，終濃度為1mM）混勻，轉入96孔板中4℃震蕩30分鐘。 4.14000rpm離心10分鐘。將上清快速吸入預冷的干凈EP管中（注意不要吸到沉淀）。 5.BCA測定蛋白濃度。 我這樣提取出來的濃度最大也就0.8mg/ml,后來每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至兩個孔加100ul的RIPA裂解液濃度也一直上不來。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，強的裂解液。 求樓主指點一下。。。。 |
6樓2016-01-08 18:43:04
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