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searush銅蟲(chóng) (初入文壇)
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關(guān)于 提取巨噬細(xì)胞蛋白問(wèn)題 已有2人參與
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請(qǐng)問(wèn)下怎么提取巨噬細(xì)胞蛋白做WB，我之前是六孔板各加250微升的RIPA，濃度測(cè)定為2-4 ug/ul。請(qǐng)問(wèn)這樣做WB可以嗎？還有裂解液用RIPA合適嗎，還是有專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞蛋白裂解液?jiǎn)幔?nbsp; 請(qǐng)指教 |
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searush
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2樓2015-01-22 11:18:53
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3樓2015-01-27 10:56:52
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4樓2015-04-08 09:37:27
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5樓2015-05-04 16:46:07
【答案】應(yīng)助回帖
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我最近也在從巨噬細(xì)胞中提取蛋白，但是濃度遠(yuǎn)比樓主的低，不知道樓主是怎么做到的，方便說(shuō)一下么。 我先說(shuō)說(shuō)我是怎么做的： 先是鋪板后給藥，提蛋白前細(xì)胞已經(jīng)特別密集的分布到六孔板中有些甚至疊起來(lái)。 1.細(xì)胞用培養(yǎng)基吹打下來(lái)，收集細(xì)胞懸液1000rpm離心5分鐘。 2.用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后盡可能吸干上清。 3.每孔加入150μl RIPA裂解液（臨用前加入PMSF，終濃度為1mM）混勻，轉(zhuǎn)入96孔板中4℃震蕩30分鐘。 4.14000rpm離心10分鐘。將上清快速吸入預(yù)冷的干凈EP管中（注意不要吸到沉淀）。 5.BCA測(cè)定蛋白濃度。 我這樣提取出來(lái)的濃度最大也就0.8mg/ml,后來(lái)每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至兩個(gè)孔加100ul的RIPA裂解液濃度也一直上不來(lái)。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，強(qiáng)的裂解液。 求樓主指點(diǎn)一下。。。。 |
6樓2016-01-08 18:43:04
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