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lxx707金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助：擴(kuò)線粒體基因組全序，中間有一段怎么都擴(kuò)不出來(lái)，不知道還能采取什么方法？ 已有5人參與
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| 設(shè)計(jì)了不下20對(duì)引物了，有5對(duì)能擴(kuò)出2000左右的片段，但一般測(cè)序不出來(lái)。拿去克隆，再測(cè)序。再不同公司做了比較，有一段2000bp兩個(gè)公司做得一樣，但是NCBI BLAST無(wú)結(jié)果。其他三段比對(duì)不想似，NCBI上也比不出任何東西。萬(wàn)能的親們，請(qǐng)多多指教，多給注意，實(shí)在是太感謝了！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lxx707(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-01-28 22:09:10
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lxx707(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-01-28 22:09:10
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一般超過(guò)2000長(zhǎng)度的，首選Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase。 其擴(kuò)增效率高，錯(cuò)誤率極低，或許能夠解決你的問(wèn)題 關(guān)于測(cè)序，最好克隆到載體內(nèi)去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果來(lái)說(shuō)，2000bp都什么沒(méi)比對(duì)上很奇怪，你就是亂打的數(shù)據(jù)都能比對(duì)上好多，對(duì)于你的描述更多可能是克隆的片段出現(xiàn)問(wèn)題，并不是你要的東西。 重新在進(jìn)行克隆測(cè)序，會(huì)有一些新的提示 |
2樓2015-01-28 19:15:28
zshw_001
金蟲 (小有名氣)
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3樓2015-01-28 21:08:00
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4樓2015-01-28 21:18:18
lxx707
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5樓2015-08-26 16:23:24
lxx707
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6樓2015-08-26 16:23:49
lxx707
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7樓2015-08-26 16:24:13
978835147
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8樓2015-11-17 19:58:49
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【答案】應(yīng)助回帖
| 我也出現(xiàn)過(guò)你這個(gè)問(wèn)題，返回來(lái)的測(cè)序結(jié)果blast一下居然沒(méi)有相似序列，可能上游或者下游序列有問(wèn)題，產(chǎn)生了錯(cuò)配，雖然能擴(kuò)出來(lái)東西，但是卻是假陽(yáng)性，我的AT值很高，開始用primerstar能擴(kuò)出來(lái)幾段，后來(lái)說(shuō)啥也擴(kuò)不出來(lái)了， 換了tks gflex酶就能擴(kuò)出來(lái)了，序列也對(duì)，我設(shè)計(jì)了一大盒引物，換酶后隨機(jī)拿以前設(shè)計(jì)的引物都可以擴(kuò)出來(lái)，建議你也試試，祝好。 |
9樓2016-02-12 11:32:06
徐官?zèng)_123
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10樓2016-02-12 11:33:12
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