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DerekSun新蟲 (初入文壇)
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[求助]
有沒有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解釋�。� 已有5人參與
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最近老師叫我用gateway做某基因完整片段的重組和表達(dá)，我做了三個(gè)月了，BP反應(yīng)還沒搞定，天天挨罵。 詳細(xì)說一下背景，目的基因大約3Kb，上游有promoter，然后接一個(gè)400Kb左右的CDS區(qū)，因?yàn)樽龅膬刹椒ǎ詀ttB引物加了adapter，引物設(shè)計(jì)了兩對，分別是從promoter前開始到stop codon的（3K左右)，還有僅僅CDS區(qū)域的。（當(dāng)然，為了測序驗(yàn)證，3KB中又分步設(shè)計(jì)了很多引物）。BP的載體用的gateway入門載體pDnor201，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α。 接上attB引物后，做了電泳驗(yàn)證，在3K和500bp的地方都有條帶，所以到此應(yīng)該沒問題。 接下來就問題不斷了，首先我BP反應(yīng)后轉(zhuǎn)入菌，培養(yǎng)后涂平板，發(fā)現(xiàn)不長菌。 然后我將BP反應(yīng)時(shí)間從1h延長到shake3h，結(jié)果有足夠的菌了。 可是隨機(jī)挑了4處菌，做colony PCR，結(jié)果電泳后都沒有條帶。硬著頭皮做了一個(gè)sample并拿去測序，什么也沒測出來。 那么問題就來了。。。 照理說gateway 控制假陽性效果是非常好的，因?yàn)槲肄D(zhuǎn)進(jìn)去的話，載體中的ccdm毒蛋白基因一定被置換出來了，則空載體不能生存，而且平板是Kanamycin的，所以雜菌應(yīng)該不會長。那么培養(yǎng)出來的菌落一定是對的才是啊，可為什么做了四個(gè)colony PCR結(jié)果都跑不出目的片段呢。 現(xiàn)在非常糾結(jié)，老師就是堅(jiān)信我技術(shù)不行，我也不知道我錯哪了。奉上四張圖，分別是長出的菌落，還有四個(gè)colonyPCR電泳的結(jié)果，以及備份這四個(gè)的mass plate。 請有經(jīng)驗(yàn)的人幫我分析下原因和下一步怎么做好。 colony.png gel.png massplate.png |
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2015-02-05 09:49:00, 365.87 K
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2樓2015-02-05 16:14:49
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【答案】應(yīng)助回帖
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個(gè)人經(jīng)驗(yàn)：大于1KB的片段不管是做TOPO還是BP都很難做了。樓主的問題我們實(shí)驗(yàn)室之前也遇到過。采取的方法是加大反應(yīng)體系的片段和質(zhì)粒濃度。 目的片段和載體均200ng以上（所以要求回收濃度要足夠高，多擴(kuò)增幾管，然后回收到一個(gè)柱子里），然后還有1ul BP clonase 總共3微升體系 25℃過夜。第二天轉(zhuǎn)化DH5a 另帖子里提到400kb的CDS? 是400bp吧？ 如果是400bp的話，應(yīng)該很好連，基本滿min都是陽性。片段長的話，長得克隆就會很少，但大部分也都是陽性 祝實(shí)驗(yàn)順利 |
8樓2017-06-25 14:00:29
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