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有沒有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解釋��！ 已有5人參與
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最近老師叫我用gateway做某基因完整片段的重組和表達，我做了三個月了，BP反應(yīng)還沒搞定，天天挨罵。 詳細說一下背景，目的基因大約3Kb，上游有promoter，然后接一個400Kb左右的CDS區(qū)，因為做的兩步法，所以attB引物加了adapter，引物設(shè)計了兩對，分別是從promoter前開始到stop codon的（3K左右)，還有僅僅CDS區(qū)域的。（當然，為了測序驗證，3KB中又分步設(shè)計了很多引物）。BP的載體用的gateway入門載體pDnor201，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α。 接上attB引物后，做了電泳驗證，在3K和500bp的地方都有條帶，所以到此應(yīng)該沒問題。 接下來就問題不斷了，首先我BP反應(yīng)后轉(zhuǎn)入菌，培養(yǎng)后涂平板，發(fā)現(xiàn)不長菌。 然后我將BP反應(yīng)時間從1h延長到shake3h，結(jié)果有足夠的菌了。 可是隨機挑了4處菌，做colony PCR，結(jié)果電泳后都沒有條帶。硬著頭皮做了一個sample并拿去測序，什么也沒測出來。 那么問題就來了。。。 照理說gateway 控制假陽性效果是非常好的，因為我轉(zhuǎn)進去的話，載體中的ccdm毒蛋白基因一定被置換出來了，則空載體不能生存，而且平板是Kanamycin的，所以雜菌應(yīng)該不會長。那么培養(yǎng)出來的菌落一定是對的才是啊，可為什么做了四個colony PCR結(jié)果都跑不出目的片段呢。 現(xiàn)在非常糾結(jié)，老師就是堅信我技術(shù)不行，我也不知道我錯哪了。奉上四張圖，分別是長出的菌落，還有四個colonyPCR電泳的結(jié)果，以及備份這四個的mass plate。 請有經(jīng)驗的人幫我分析下原因和下一步怎么做好。 colony.png gel.png massplate.png |
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