 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2716 | 回復(fù): 7 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
DerekSun新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
有沒有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解釋��！ 已有5人參與
|
||
最近老師叫我用gateway做某基因完整片段的重組和表達(dá)，我做了三個月了，BP反應(yīng)還沒搞定，天天挨罵。 詳細(xì)說一下背景，目的基因大約3Kb，上游有promoter，然后接一個400Kb左右的CDS區(qū)，因為做的兩步法，所以attB引物加了adapter，引物設(shè)計了兩對，分別是從promoter前開始到stop codon的（3K左右)，還有僅僅CDS區(qū)域的。（當(dāng)然，為了測序驗證，3KB中又分步設(shè)計了很多引物）。BP的載體用的gateway入門載體pDnor201，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α。 接上attB引物后，做了電泳驗證，在3K和500bp的地方都有條帶，所以到此應(yīng)該沒問題。 接下來就問題不斷了，首先我BP反應(yīng)后轉(zhuǎn)入菌，培養(yǎng)后涂平板，發(fā)現(xiàn)不長菌。 然后我將BP反應(yīng)時間從1h延長到shake3h，結(jié)果有足夠的菌了。 可是隨機(jī)挑了4處菌，做colony PCR，結(jié)果電泳后都沒有條帶。硬著頭皮做了一個sample并拿去測序，什么也沒測出來。 那么問題就來了。。。 照理說gateway 控制假陽性效果是非常好的，因為我轉(zhuǎn)進(jìn)去的話，載體中的ccdm毒蛋白基因一定被置換出來了，則空載體不能生存，而且平板是Kanamycin的，所以雜菌應(yīng)該不會長。那么培養(yǎng)出來的菌落一定是對的才是啊，可為什么做了四個colony PCR結(jié)果都跑不出目的片段呢。 現(xiàn)在非常糾結(jié)，老師就是堅信我技術(shù)不行，我也不知道我錯哪了。奉上四張圖，分別是長出的菌落，還有四個colonyPCR電泳的結(jié)果，以及備份這四個的mass plate。 請有經(jīng)驗的人幫我分析下原因和下一步怎么做好。 colony.png gel.png massplate.png |
回復(fù)此樓» 本帖附件資源列表
-
歡迎監(jiān)督和反饋：小木蟲僅提供交流平臺，不對該內(nèi)容負(fù)責(zé)。
本內(nèi)容由用戶自主發(fā)布，如果其內(nèi)容涉及到知識產(chǎn)權(quán)問題，其責(zé)任在于用戶本人，如對版權(quán)有異議，請聯(lián)系郵箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : image(1).jpeg
- 附件 2 : image(2).jpeg
- 附件 3 : image.jpeg
2015-02-05 09:49:00, 365.87 K
2015-02-05 09:49:04, 368.57 K
2015-02-05 09:49:08, 387.37 K
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有164人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有3人回復(fù)
starseacow
專家顧問 (職業(yè)作家)
-
專家經(jīng)驗: +426 - MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 1217 (講師)
- 金幣: 9097.3
- 散金: 16445
- 紅花: 226
- 帖子: 4669
- 在線: 2320.2小時
- 蟲號: 1136974
- 注冊: 2010-11-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物生理與生化
- 管轄: 動植物
4樓2015-02-05 19:31:18
zshw_001
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 77 (初中生)
- 金幣: 506.4
- 帖子: 171
- 在線: 27.6小時
- 蟲號: 1151714
- 注冊: 2010-11-20
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
2樓2015-02-05 16:14:49
DerekSun
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1
- 帖子: 3
- 在線: 2.5小時
- 蟲號: 3673512
- 注冊: 2015-02-01
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
3樓2015-02-05 17:09:54
5樓2015-02-06 10:49:34
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085404 22408 315分 +3 | zhuangyan123 2026-03-31 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +6 | 丹青奶蓋 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求化學(xué)調(diào)劑 +11 | wulanna 2026-03-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +6 | 小懶蟲不懶了 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +10 | 張zz111 2026-03-27 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京工業(yè)大學(xué)，324分求調(diào)劑 +6 | 零八# 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 【求調(diào)劑】085601材料工程專碩 | 總分272 | +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +10 | 15188958825 2026-03-25 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 349求調(diào)劑 +6 | 李木子啊哈哈 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 2026年華南師范大學(xué)歡迎化學(xué)，化工，生物，生醫(yī)工等專業(yè)優(yōu)秀學(xué)子加入！ +3 | llss0711 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856材料化工調(diào)劑 總分330 +14 | zhubinhao 2026-03-27 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 085600，專業(yè)課化工原理，321分求調(diào)劑 +5 | 大饞小子 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 數(shù)一英一271專碩（085401）求調(diào)劑，可跨 +7 | 前行必有光 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +14 | 鵝鵝鵝額額額額?/a> 2026-03-25 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑，各位老師看看我�。�！ +5 | 祁祺祺 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 298調(diào)劑 +3 | jiyingjie123 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 314求調(diào)劑 +3 | 溪云珂 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 336材料求調(diào)劑 +7 | 陳瀅瑩 2026-03-26 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)339材料與化工求調(diào)劑 +3 | 江往賣魚 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 086003食品工程求調(diào)劑 +6 | 淼淼111 2026-03-24 | 6/300 |
|