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guxy4869銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞時siRNA與Lipofectamine2000的比例 已有3人參與
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最近開始做siRNA轉(zhuǎn)染，遇到了很多問題，但實(shí)驗(yàn)室里之前無人做過這方面的實(shí)驗(yàn)，特此懇請各位轉(zhuǎn)染大神幫助！ 我要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系是轉(zhuǎn)染最常用HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染體系是6孔板和6 cm皿，目的是要敲低一個分子量300多kD的蛋白質(zhì)，3條siRNA和Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司。 轉(zhuǎn)染前檢測了siRNA的量，確定沒有降解。EP管和槍頭均是無RNA酶的。轉(zhuǎn)染過程中使用的培養(yǎng)基是OPTI-MEM，種細(xì)胞及換液用的培養(yǎng)基均為不含青鏈霉素的10%FBS的MEM培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度為80%~90%。 根據(jù)Lipo2000說明書的推薦用量（75 pmol siRNA:7.5 uL Lipo2000）、Invitrogen公司網(wǎng)頁上針對293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染protocol（500 pmol siRNA: 5 uL Lipo2000）和之前在丁香園看到的Lipo2000的使用說明（100 pmol siRNA:5 uL Lipo2000）做過嘗試，轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h、48 h后通過IF檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)（因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需要一些熒光照片，鑒于已有抗體的局限性，未對siRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記），但是都沒有達(dá)到轉(zhuǎn)染效果。 文獻(xiàn)中大多使用的siRNA終濃度為100 nM，在6孔板體系(2.5 mL)中也就是250 pmol siRNA，我試過用5 uL、7.5 uL、12.5 uL Lipo2000去轉(zhuǎn)染，但是也沒有作用。到底是siRNA序列不合適還是轉(zhuǎn)染體系不對，我到現(xiàn)在還是云里霧里......而且在6孔板中，每孔Lipo2000的用量上限是多少我也完全搞不清楚......由于我用siRNA干擾后還需要加藥物處理細(xì)胞，如果轉(zhuǎn)染時細(xì)胞量就達(dá)90%，再加藥物處理就跟平常不干擾時的體系不一樣了，擔(dān)心會有影響，但看了很多帖子都說細(xì)胞匯合度對轉(zhuǎn)染效率很重要，到底能不能降低呢？ 懇請各位大神指點(diǎn)，不甚感激�。。。�！ |
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siRNA 轉(zhuǎn)染 （權(quán)陽生物轉(zhuǎn)載） A．siRNA轉(zhuǎn)染的方法 脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染需要注重的幾點(diǎn) 哺乳動物轉(zhuǎn)染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機(jī)械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質(zhì)體試劑，其中陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法。 轉(zhuǎn)染試劑的用量 siRNA的用量 轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度 轉(zhuǎn)染時的操作順序 轉(zhuǎn)染時的操作順序 細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的溫浴的時間 B．Lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamin2000的應(yīng)用領(lǐng)域 選擇最適合的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件，往往取決于不同的哺乳動物細(xì)胞類型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000適用于核酸的體內(nèi)和體外操作，可應(yīng)用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉(zhuǎn)染，也可應(yīng)用于DNA/siRNA 的共轉(zhuǎn)染操作；是一種新型的高效siRNA轉(zhuǎn)染試劑。 原代培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染 siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗(yàn) DNA轉(zhuǎn)染；DNA和siRNA的共轉(zhuǎn)染 核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內(nèi)導(dǎo)入試驗(yàn) 貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Lipofectamin2000 的特點(diǎn)： 不必更換培養(yǎng)基，操作簡便易行，可在半小時內(nèi)完成操作 在含血清培養(yǎng)基中也能表現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率 細(xì)胞毒性低；適用細(xì)胞廣泛 即用型試劑，可在含有抗生素的完全培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染 基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，確保沒有RNAse活性 □ 可介導(dǎo)siRNA高轉(zhuǎn)染細(xì)胞及體內(nèi)siRNA的高效導(dǎo)入 C．Lipofectamin2000適用的細(xì)胞類型 Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞系的DNA和siRNA轉(zhuǎn)染如： HeLa(人頸部癌 細(xì)胞)、MCF-7(人乳房癌細(xì)胞)、Hep3B(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞)、COS-7(猴腎細(xì)胞)、Neuro-2a(鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)、NIKS(人角 質(zhì)化細(xì)胞)、B16(鼠黑素瘤細(xì)胞)、DLD-1(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細(xì)胞)、HT-29(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)、A549(人肺 癌細(xì)胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細(xì)胞)和293(腺病毒5 DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞),SVRbag4細(xì)胞等。 D．轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng) 在細(xì)胞板上培養(yǎng)細(xì)胞時，應(yīng)使細(xì)胞匯合在24小時內(nèi)達(dá)到70-90%。 細(xì)胞培養(yǎng)用品 表面積（mm2/孔） 細(xì)胞密度 培養(yǎng)基（μL /孔） 96孔板 50 1.5´104-5.0´104 100μL 48孔板 100 3.0´104-1.0´105 200μL 24孔板 200 8.0´104-2.0´105 500μL 12孔板 401 1.6´105-4.0´105 1.0 mL 6孔板 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL 35 mm 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL 60 mm 2827 1.0´106-2.5´106 6.0 mL E．合適的lipofectamin2000用量 合適的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例對核酸的高效轉(zhuǎn)染有重要影響；我們推薦的 DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000為 1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內(nèi)都可獲得高的轉(zhuǎn)染效率。 細(xì)胞培養(yǎng)用品 siRNA/DNA 培養(yǎng)基最終體積 Lipofectamin2000(siRNA/DNA) 96孔板 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl 24孔板 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl 12孔板 40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl 6孔板 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl 35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl 60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl F．貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序 轉(zhuǎn)染前一天，4-5´104細(xì)胞接種在24孔板上， 0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養(yǎng)基）細(xì)胞培養(yǎng)基。 選用生理狀態(tài)良好的細(xì)胞對提高轉(zhuǎn)染效率很 2． 選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。 重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）無血清培養(yǎng)基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻； 混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉(zhuǎn)染時，則加入2μllipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘； 將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復(fù)合物。 將100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板。 7． 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。 G．懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序 轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，收集細(xì)胞離心，用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）無血清的培養(yǎng)基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻； 混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉(zhuǎn)染時，則加入2μl lipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘； 將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復(fù)合物。 再加入400μL細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞數(shù)量決定于細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)染后分析測試的時間）。 6． 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。 H．DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染的前一天，4-5´104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基。 選擇用于初期接種的細(xì)胞密度，應(yīng)能在24小時內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。 在100μL的無血清的培養(yǎng)基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin復(fù)合物。 將siRNA/ DNA/lipofectamin復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻。 5． 細(xì)胞在37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它步驟。 I．siRNA體內(nèi)導(dǎo)入方法 適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，因?yàn)樽⑸湟后w積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。 取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復(fù)合物與lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和 0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無菌水中，將1#管 中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-lipofectamin復(fù)合物。 3． 制備的siRNA/DNA-lipofectamine復(fù)合物可用于體內(nèi)導(dǎo)入siRNA、DNA或siRNA\DNA。 |
2樓2015-05-04 01:07:35
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3樓2018-10-08 15:56:38
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4樓2018-10-16 11:05:25
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【答案】應(yīng)助回帖
| HEK293屬于比較好轉(zhuǎn)染的一類細(xì)胞株，如果是第一次做，建議現(xiàn)用24孔板摸一下條件，RFect siRNA轉(zhuǎn)染試劑2ul，設(shè)置siRNA梯度設(shè)置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個梯度，每個梯度最好做2-3個復(fù)孔（至少2個復(fù)孔，避免實(shí)驗(yàn)誤差）。檢測方法：轉(zhuǎn)染后48h收細(xì)胞做qPCR基因水平檢測或者轉(zhuǎn)染后72h收細(xì)胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測。Lipo2000毒性較大，容易造成細(xì)胞死亡，不推薦使用。 |
5樓2018-11-13 14:41:00
6樓2018-11-23 11:01:05
7樓2018-11-30 11:22:29
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