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轉(zhuǎn)染HEK293細胞時siRNA與Lipofectamine2000的比例 已有3人參與
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最近開始做siRNA轉(zhuǎn)染，遇到了很多問題，但實驗室里之前無人做過這方面的實驗，特此懇請各位轉(zhuǎn)染大神幫助！ 我要轉(zhuǎn)染的細胞系是轉(zhuǎn)染最常用HEK293細胞，轉(zhuǎn)染體系是6孔板和6 cm皿，目的是要敲低一個分子量300多kD的蛋白質(zhì)，3條siRNA和Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司。 轉(zhuǎn)染前檢測了siRNA的量，確定沒有降解。EP管和槍頭均是無RNA酶的。轉(zhuǎn)染過程中使用的培養(yǎng)基是OPTI-MEM，種細胞及換液用的培養(yǎng)基均為不含青鏈霉素的10%FBS的MEM培養(yǎng)基，細胞匯合度為80%~90%。 根據(jù)Lipo2000說明書的推薦用量（75 pmol siRNA:7.5 uL Lipo2000）、Invitrogen公司網(wǎng)頁上針對293細胞的轉(zhuǎn)染protocol（500 pmol siRNA: 5 uL Lipo2000）和之前在丁香園看到的Lipo2000的使用說明（100 pmol siRNA:5 uL Lipo2000）做過嘗試，轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h、48 h后通過IF檢測目標蛋白的表達（因為實驗需要一些熒光照片，鑒于已有抗體的局限性，未對siRNA進行熒光標記），但是都沒有達到轉(zhuǎn)染效果。 文獻中大多使用的siRNA終濃度為100 nM，在6孔板體系(2.5 mL)中也就是250 pmol siRNA，我試過用5 uL、7.5 uL、12.5 uL Lipo2000去轉(zhuǎn)染，但是也沒有作用。到底是siRNA序列不合適還是轉(zhuǎn)染體系不對，我到現(xiàn)在還是云里霧里......而且在6孔板中，每孔Lipo2000的用量上限是多少我也完全搞不清楚......由于我用siRNA干擾后還需要加藥物處理細胞，如果轉(zhuǎn)染時細胞量就達90%，再加藥物處理就跟平常不干擾時的體系不一樣了，擔心會有影響，但看了很多帖子都說細胞匯合度對轉(zhuǎn)染效率很重要，到底能不能降低呢？ 懇請各位大神指點，不甚感激�。。。�！ |
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siRNA 轉(zhuǎn)染 （權(quán)陽生物轉(zhuǎn)載） A．siRNA轉(zhuǎn)染的方法 脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染需要注重的幾點 哺乳動物轉(zhuǎn)染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質(zhì)體試劑，其中陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法。 轉(zhuǎn)染試劑的用量 siRNA的用量 轉(zhuǎn)染時的細胞密度 轉(zhuǎn)染時的操作順序 轉(zhuǎn)染時的操作順序 細胞與轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復合物的溫浴的時間 B．Lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamin2000的應用領域 選擇最適合的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件，往往取決于不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000適用于核酸的體內(nèi)和體外操作，可應用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉(zhuǎn)染，也可應用于DNA/siRNA 的共轉(zhuǎn)染操作；是一種新型的高效siRNA轉(zhuǎn)染試劑。 原代培養(yǎng)細胞和轉(zhuǎn)化細胞株的基因轉(zhuǎn)染 siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗 DNA轉(zhuǎn)染；DNA和siRNA的共轉(zhuǎn)染 核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內(nèi)導入試驗 貼壁細胞和懸浮細胞轉(zhuǎn)染 Lipofectamin2000 的特點： 不必更換培養(yǎng)基，操作簡便易行，可在半小時內(nèi)完成操作 在含血清培養(yǎng)基中也能表現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率 細胞毒性低；適用細胞廣泛 即用型試劑，可在含有抗生素的完全培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染 基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，確保沒有RNAse活性 □ 可介導siRNA高轉(zhuǎn)染細胞及體內(nèi)siRNA的高效導入 C．Lipofectamin2000適用的細胞類型 Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑可廣泛應用于多種細胞系的DNA和siRNA轉(zhuǎn)染如： HeLa(人頸部癌 細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞)、NIKS(人角 質(zhì)化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結(jié)腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結(jié)腸腺癌細胞)、A549(人肺 癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒5 DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細胞),SVRbag4細胞等。 D．轉(zhuǎn)染前細胞培養(yǎng) 在細胞板上培養(yǎng)細胞時，應使細胞匯合在24小時內(nèi)達到70-90%。 細胞培養(yǎng)用品 表面積（mm2/孔） 細胞密度 培養(yǎng)基（μL /孔） 96孔板 50 1.5´104-5.0´104 100μL 48孔板 100 3.0´104-1.0´105 200μL 24孔板 200 8.0´104-2.0´105 500μL 12孔板 401 1.6´105-4.0´105 1.0 mL 6孔板 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL 35 mm 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL 60 mm 2827 1.0´106-2.5´106 6.0 mL E．合適的lipofectamin2000用量 合適的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例對核酸的高效轉(zhuǎn)染有重要影響；我們推薦的 DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000為 1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內(nèi)都可獲得高的轉(zhuǎn)染效率。 細胞培養(yǎng)用品 siRNA/DNA 培養(yǎng)基最終體積 Lipofectamin2000(siRNA/DNA) 96孔板 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl 24孔板 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl 12孔板 40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl 6孔板 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl 35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl 60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl F．貼壁細胞轉(zhuǎn)染程序 轉(zhuǎn)染前一天，4-5´104細胞接種在24孔板上， 0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養(yǎng)基）細胞培養(yǎng)基。 選用生理狀態(tài)良好的細胞對提高轉(zhuǎn)染效率很 2． 選擇用于初期接種的細胞數(shù)量，應能在24小時內(nèi)使細胞匯合達到70-90%。 重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦范圍內(nèi)適當調(diào)整。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）無血清培養(yǎng)基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻； 混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉(zhuǎn)染時，則加入2μllipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘； 將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復合物。 將100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復合物加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板板。 7． 細胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養(yǎng)基。 G．懸浮細胞轉(zhuǎn)染程序 轉(zhuǎn)染的當天，收集細胞離心，用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）無血清的培養(yǎng)基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻； 混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉(zhuǎn)染時，則加入2μl lipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘； 將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復合物。 再加入400μL細胞懸浮液（細胞數(shù)量決定于細胞類型和轉(zhuǎn)染后分析測試的時間）。 6． 細胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養(yǎng)基。 H．DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染細胞 在轉(zhuǎn)染的前一天，4-5´104細胞接種在24孔板上，0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的細胞培養(yǎng)基。 選擇用于初期接種的細胞密度，應能在24小時內(nèi)使細胞匯合達到70-90%。 在100μL的無血清的培養(yǎng)基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin復合物。 將siRNA/ DNA/lipofectamin復合物加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻。 5． 細胞在37℃溫育24h-48h后，進行轉(zhuǎn)染后的其它步驟。 I．siRNA體內(nèi)導入方法 適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，因為注射液體積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。 取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復合物與lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和 0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無菌水中，將1#管 中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-lipofectamin復合物。 3． 制備的siRNA/DNA-lipofectamine復合物可用于體內(nèi)導入siRNA、DNA或siRNA\DNA。 |
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