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HX91926銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
請問過柱子純化之后，跑膠什么都沒有啥原因 已有6人參與
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做了好幾次了，都是純化之后的什么都沒有，但穿流液就有，我的表達(dá)量不是很明顯，因?yàn)楸磉_(dá)低的原因嗎。 還有因?yàn)楸磉_(dá)量不明顯的原因，跑粗蛋白的時(shí)候能看到那條帶，有時(shí)候又感覺看不到，所以我不是很確定我的表達(dá)出來了，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室做不了western，但我感覺應(yīng)該有。 沒有表達(dá)原因大嗎。還有什么別的原因嗎 |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測 |
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HX91926
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2樓2015-03-08 14:34:47
linxi8579
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3樓2015-03-08 21:58:53
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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我也做這個(gè)，用的生工公司的柱子（ni柱） 1、穿透液有是正常的，但如果只有穿透液有，那就是掛柱子不好的原因了，掛的不好解決方法有（我是從木蟲總結(jié)出來的） （1） 洗脫條件過于溫和（組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)仍綁定）：通過咪唑梯度洗脫或降低pH值至最佳洗脫條件。 （2） 蛋白質(zhì)沉淀或在柱中：嘗試清潔劑或改變NaCl濃度或在變性（展開）條件（使用4-8尿素或4-6鹽酸胍）洗脫，以除去沉淀的蛋白質(zhì)。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，減少樣品的量，或減少蛋白質(zhì)通過用線性梯度的咪唑代替濃度咪唑洗脫。 （3） 非特異性疏水性或其他相互作用：在洗脫緩沖液添加非離子洗滌劑（例如，0.2％的Triton X-100）或改變氯化鈉濃度。 （4） 樣品中和/或結(jié)合緩沖液的咪唑濃度太高：該蛋白質(zhì)被包被于穿透液中。做實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)減少樣品和/結(jié)合緩沖液的咪唑濃度。 （5） 靶蛋白可能不是組氨酸標(biāo)簽如預(yù)期：確認(rèn)DNA序列。分析誘導(dǎo)前的樣品，例如，蛋白的Western印跡實(shí)驗(yàn)。 （6） 組氨酸標(biāo)簽可能不充分暴露：將蛋白質(zhì)在發(fā)現(xiàn)流過的材料。在尿素或鹽酸胍進(jìn)行包涵體折疊蛋白純化。 2、表達(dá)量低也是一個(gè)原因，因?yàn)榧兓袚p失，另外蛋白純化時(shí)被高度稀釋了，如果表達(dá)量太低，那后期純化不明顯。建議你先用超濾膜超濾濃縮一下再跑膠試試，如果不行，你可以再優(yōu)化一下表達(dá)條件，表達(dá)量高了再做純化（我是等不及了，要畢業(yè)了有木有，做不出來都是淚�。� 3、祝你成功，共勉吧，嗚嗚 |
4樓2015-03-09 08:40:54
HX91926
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7樓2015-03-12 16:05:17
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8樓2015-03-12 16:08:05
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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做層析的孩紙們經(jīng)常都會碰到這樣的問題，也不要太灰心。。 看樓主用的是什么樣的介質(zhì)，確定目的蛋白肯定會在洗脫里面而不是穿透里面嗎？ 還有表達(dá)量低導(dǎo)致產(chǎn)物少，層析之后量就更少是很有可能的，所以跑電泳前可以先用超濾濃縮管濃縮（不過也可能損失一點(diǎn)蛋白）。。。 再就是如果確定粗蛋白電泳能看到目的條帶的話，層析后的樣品看不到條帶可能是靈敏度不夠，可以考慮用銀染，畢竟它的分辨率傳說中能達(dá)到ng級~ 最后，祝好運(yùn)�。。⊥瑠^斗在生化實(shí)驗(yàn)道路上的人兒~  |
9樓2015-03-12 16:29:11
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