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wangkaibo123

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[交流] 《讀懂天然產(chǎn)物》系列-16-皮氏反應催化生物堿合成的“神奇之旅” 已有1人參與

《讀懂天然產(chǎn)物系列》（新年伊始，讀懂天然產(chǎn)物系列作品將會陸續(xù)上傳，雖有自娛自樂之說，但我們真切希望廣大蟲友們能積極參與進來，一起討論、學習。歡迎各位蟲友前往閱讀、訂閱及留言）
淘帖鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/taotie.php?action=view&ttid=55868

上一帖：《讀懂天然產(chǎn)物系列》-15-基因與化學聯(lián)姻：破譯生物合成70年未解之謎 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=8506439&fpage=1

您的選擇：《讀懂天然產(chǎn)物系列》誠邀您撰寫屬于您自己的文獻評論！
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故事從1911年說起，在瑞士日內(nèi)瓦大學，當兩位著名的化學家Ame Pictet 和Theodor Spengler將-苯乙胺與甲醛縮二甲醇兩種物質(zhì)在鹽酸條件下加熱時，神奇的環(huán)加成反應發(fā)生了，這就是著名的皮氏反應（Pictet-Spengler Reaction，PSR）.皮氏反應至發(fā)現(xiàn)以來，已有超過100年的歷史，100多年來，即使到現(xiàn)在，該反應在異喹啉類及吲哚類生物堿的合成中都發(fā)揮了巨大的作用，為人類的醫(yī)藥事業(yè)發(fā)揮了不可估量的價值，可以說是最成功的合成反應之一。但是，在神奇的自然界，該反應則不止百年的歷史，我們可以追溯到6000年以前，在那個時候，PS反應合成的重要生物堿--嗎啡，則已然在自然界存在。人類利用嗎啡作為藥物，基本同步與人類文明的起源，埃及有明文記載：在3500年前，嗎啡曾作為補藥被人類食用。由此可見，自然界的卓越才華，遠遠超過了人類的智慧，我們完全有理由，有信心去探尋自然界中更多的化合物，更多的天然藥物，發(fā)現(xiàn)更多有趣的有機催化反應。接下來，我將首先簡單介紹催化PS反應的幾種酶。

1. Strictosidine Synthases (STRs)：這是發(fā)現(xiàn)并分離純化得到的第一個催化PS反應的酶，與1975年由耶魯大學的科學家發(fā)現(xiàn)，相關(guān)成果發(fā)表于A. I. Scott, S. L. Lee, J. Am. Chem. Soc.1975, 97, 6906 – 6908.（附件參考文獻1）。這類酶主要催化單萜吲哚類生物堿的生物合成，迄今大約有2500多種此類型的單萜吲哚生物堿由此酶催化而得。該類酶的立體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定，有多種亞型，相關(guān)文獻見附件2,3。該酶催化的主要類型生物堿合成如下圖。

2. Strictosidine Synthases (NCS)：這是發(fā)現(xiàn)并分離純化得到的第二個催化PS反應的酶，與STRs酶發(fā)現(xiàn)之后不久得到。這類酶主要催化異喹啉類生物堿的生物合成，至今發(fā)現(xiàn)大約有3000多種此類型的生物堿。該類酶的立體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被確定，相關(guān)文獻見附件4。該酶催化的主要類型生物堿合成如下圖。

3. non-ribosomal peptide synthetase SfmC：這是一種有開發(fā)潛力的抗癌藥Saframycin A的生物合成酶，該化合物的形成需要該酶的催化，相關(guān)結(jié)果發(fā)表于Nature chemical biology（附件文獻5）。該酶催化形成Saframycin A的途徑如下圖。

4 McbB：這是一種催化卡波林生物堿合成的酶，由南海海洋研究所鞠建華老師課題組鑒定發(fā)現(xiàn)，這是本次重點介紹的文獻。文獻信息（附件文獻6）：

卡波林生物堿亦是由PS反應催化而來，但是該類生物堿結(jié)構(gòu)骨架沒有單萜吲哚生物堿復雜，因此合成該類化合物的酶應不同于單萜吲哚生物堿，探測卡波林生物堿合成的酶將具有重要意義，本次實驗結(jié)果也為卡波林生物堿的研究以及該類生物堿的合成提供重要的參考。

文章中主要是鑒定控制該類酶合成的基因簇，通過基因組成可以判斷組成該酶的氨基酸是什么，但是，酶蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)并不能得到，還需廣泛的實驗進行進一步研究。文章中的卡波林類生物堿分離自深海海洋微生物，給基因簇的確定提供了可能。

文章中， 1、作者首先觀察分離得到的生物堿的共同特征：芳香取代的乙胺基、不飽和的C環(huán)。則推測負責卡波林母核構(gòu)建的酶應具有脫羧酶和脫氫或者氧化酶的活性，進而進行散彈法基因篩選，同時考慮到化合物1涉及酰胺鍵的合成，最終鎖定DNA骨架中27號位置應該負責卡波林母核的構(gòu)建。進而通過質(zhì)粒異源性表達確定27號位置中11.2kb長度的DNA片段中包含13個開放性閱讀框架的DNA片段負責MCB卡波林骨架的構(gòu)建。2、通過基因突變的發(fā)酵實驗，確定13個開放性框架中-7到-1，+1到+3均未參與催化作用，至此目標基因縮小至A,B,C 3個基因片段。基因信息學分析結(jié)合與已知基因功能比對，確定A為乙酰輔酶A連接酶，B為卡波林母核構(gòu)建酶，C為脫羧酶。3、為了進一步驗證ABC 3個酶足夠進行MCB化合物的生合成，進行基因克隆實驗，發(fā)酵分離，結(jié)果證實了3個酶足夠進行卡波林母核的構(gòu)建，同時確定酶B單獨即可形成卡波林類化合物。但是母核構(gòu)建時C3單元不能確定來自什么地方，作者推測可能來自丙酮酸類的直接的C3單元。4、用同位素標記的方法探索C3單元來自何處，一系列同位素培養(yǎng)實驗最終證明C3單元來自二個乙酸單元。至此，實驗還沒有結(jié)束，作者又想探索酶B中哪些氨基酸為主要負責催化的活性氨基酸。5、進行基因突變發(fā)酵培養(yǎng)實驗，結(jié)果證明酶B中的N-末端殘基主要參與了骨架的構(gòu)建，同時發(fā)現(xiàn)E97氨基酸殘基是催化反應進行，必不可少的功能基團。6、到這兒，整個實驗畫個完美的句點，作者總結(jié)以上實驗數(shù)據(jù)，提出了化合物1-6的生合成路線，見下圖。同時，作者對各個反應進行思考總結(jié)，并于化學催化的PS反應進行比較，提出氧化反應為整個反應的限速步驟。整個實驗思路明確，工作細致嚴謹，工作量大，確實為一篇非常優(yōu)秀的科研性論文，值得深入學習。該文章同時擴展了卡波林生物堿的生物合成知識，也為探測新類型的含有卡波林母核的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供了理論性指導。

討論：
在閱讀中，我注意到一個問題，STRs催化形成的是3S構(gòu)型的產(chǎn)物，NCS催化形成S構(gòu)型產(chǎn)物， non-ribosomal peptide synthetase SfmC亦催化形成立體單一性產(chǎn)物，但是在簡單卡波林生物堿的合成中，則出現(xiàn)了消旋體的產(chǎn)物，如下圖化合物3abcd（文獻7）。請大家分析討論為什么會出現(xiàn)這種情況，望不惜賜教。

以上即為本人對PS反應的簡單看法，相關(guān)文獻請見附件！由于個人水平有限，評論過程中一定有很多不足，請各位蟲友見諒，并提出寶貴意見，謝謝！[ Last edited by wangkaibo123 on 2015-3-12 at 22:10 ]

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附件 1 : 1_JACS_1975_ja00856a073.pdf

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附件 2 : 2_Plant_Cell-2006-Ma-907-20.pdf

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附件 3 : 3_Nature_chemical_biology_2007_PS反應.pdf

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附件 4 : 4_Angew_2011__Pictet–Spengler_Reaction.pdf

2015-03-12 22:09:16, 3.46 M

附件 5 : 5_Nature_chemical_biology_2010_PS反應構(gòu)建異喹啉類生物堿.pdf

2015-03-12 22:09:17, 366.75 K

附件 6 : 6_Angew_2014_鞠建華_卡波林生物堿生物合成研究_SI.pdf

2015-03-12 22:09:24, 3.34 M

附件 7 : 6_Angew_2014_鞠建華_卡波林生物堿生物合成研究.pdf

2015-03-12 22:09:28, 807.15 K

附件 8 : 7_s10593-014-1602-4_.pdf

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