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貼壁細(xì)胞mtt試驗(yàn)原理及方法步驟 已有1人參與
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貼壁細(xì)胞mtt試驗(yàn)原理及方法步驟是什么？新手，希望大神們說(shuō)的詳細(xì)點(diǎn)，謝謝！ |
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0724410016
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2樓2015-03-16 13:00:21
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MTT原理 MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語(yǔ)化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗 腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。 普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟： 1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul. 2: 培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。 3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。 4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟 貼壁細(xì)胞： 1: 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000- 10000 孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。 2: 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況 3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 5: 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。 7: 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。 |
3樓2015-03-16 13:09:44
4樓2015-03-16 13:28:09
lidong.0107
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5樓2015-03-17 10:43:50
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