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貼壁細胞mtt試驗原理及方法步驟 已有1人參與
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貼壁細胞mtt試驗原理及方法步驟是什么？新手，希望大神們說的詳細點，謝謝！ |
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0724410016
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2樓2015-03-16 13:00:21
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MTT原理 MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗 腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。 普通MTT法實驗步驟： 1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul. 2: 培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。 3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。 4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。 藥物MTT法實驗步驟 貼壁細胞： 1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000- 10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。 2: 5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況 3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。 4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 5: 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。 6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 7: 同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。 |
3樓2015-03-16 13:09:44
4樓2015-03-16 13:28:09
lidong.0107
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5樓2015-03-17 10:43:50
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