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秦始皇faq鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR條帶彌散，不知道是什么原因，希望各位師兄師姐幫我看看。 已有4人參與
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各位師兄師姐，我最近一直在做PCR，想同源克隆大麥——小麥，從大麥中查找的序列，然后設(shè)計(jì)的引物，模板是小麥的cdna，一般情況下跑出來得條帶是彌散的。有條帶的大小也和預(yù)計(jì)的不一樣，預(yù)計(jì)大小在1300bp左右，看圖片上的條帶都超過2000bp了。 不知道哪里出現(xiàn)了問題，模板前些日子剛用tubling擴(kuò)了一次，都是有條帶的。 第二個(gè)問題：為什么第二幅圖的條帶都是連續(xù)的兩條？我以前用小孔（10微升體系）的膠能擴(kuò)出來一條1300bp的，但是換了大孔（20微升體系）的膠（為了回收）怎么就擴(kuò)不出來了呢。 我用的酶是方塔高保真酶。 體系（10微升）：酶 0.2 引物1、引物2：各0.4 buffer： 5 dntp: 0.2 水 3.6 模板： 0.1 pcr反應(yīng)條件：95——3min 95 ——15s 53——15s(有條帶的那張)、65——15s(以前一直沒有條帶彌散，所以一直升高退火溫度，可是還沒有。。。) 72——1min30s 72—— 5min 一共33循環(huán)。 麻煩各位老師，師兄師姐幫我看看。 1.jpg 1`.jpg |
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jurkat.1640
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7樓2015-03-24 15:29:16
18761615793
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-03-24 23:12:09
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-03-24 23:12:09
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原因有很多啊 1 確定模板的純度（不純可能會(huì)有抑制PCR的東西），確定模板沒有降解 2 引物的特異性太差了，或者酶的特異性太差（一般建議1300bp不使用高保真聚合酶，一般的熱啟動(dòng)Taq酶即可） 3 buffer的質(zhì)量（或者說是PCR試劑盒的質(zhì)量吧）及buffer里是否有鎂離子，可以適當(dāng)對(duì)鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，也可以加DMSO有助于擴(kuò)增 4 你現(xiàn)在是沒有條帶擴(kuò)增出來，應(yīng)該降低退火溫度，當(dāng)你擴(kuò)增出有很多雜帶的情況下才應(yīng)該升高退火溫度 5 也可適當(dāng)?shù)臏p少循環(huán)次數(shù) 6 還有跑膠時(shí)候的電壓?jiǎn)栴}，制膠的膠的質(zhì)量 7 用水問題，水的pH值也會(huì)有影響，不能太酸 因?yàn)楝F(xiàn)在不知道問題在哪，所以在簡(jiǎn)單的原因也要考慮其中啊 希望早日找到 問題所在  |
2樓2015-03-24 09:02:51
jurkat.1640
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4樓2015-03-24 12:32:25
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