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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 藥學 » 藥理學 » 冰凍切片和HE染色
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jiangxizhongyao銅蟲 (初入文壇)
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冰凍切片和HE染色 已有17人參與
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近幾天做肝臟的病理形態(tài)學檢查，要做病理切片，找了相關(guān)資料，正好有空，就 發(fā)了這貼共看！該貼附件主要是說明冰凍切片的方法（還是個改良的）和HE染色的主要步驟。 以下是學習簡介，沒空別看。 我是一個學藥化的，老師的課題確是中藥，于是搞搞提取分離，當我做到還沒到位時，就被趕來做藥理，于是盲目找資料，幸好碰到住一起的同學做藥理，給予了指點。但是，我做的藥理還涉及病理，所以又請教相關(guān)的同學－－－－－－－－－－－為什么不請教老師：因為以前學藥化沒想到認識這不相干的人（希望蟲民們多認識人，別抱我這心態(tài)）------所以于是痛苦，可是問題還是來了，暑假同學們很多都回家了。還得繼續(xù)想辦法，就象同學說的，還得DIY！��！  所以如果有高手，還請指點一下。 正文： 冰凍切片HE染色步驟 一、操作方法及步驟： ①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。 ②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。 ③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。 ④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。 二、冰凍切片時的注意事項： ①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 ②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。 ③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。 ④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當冰凍發(fā)生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。 ⑤當切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。 ⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。 三、冰凍切片的快速染色方法： ① 切片固定30秒－1分鐘。 ② 水洗。 ③ 染蘇木素3－5分鐘。 ④ 分化。 ⑤ 于堿水中返藍20秒。 ⑥ 伊紅染色10－20秒。 ⑦ 脫水，透明，中性樹膠封固。 冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘�？偣苍�10分鐘內(nèi)完成快速制片過程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來說已很少使用，因此在這里不作闡述。 常規(guī)方法： （1）冰凍切片固定 10～30 s （2）稍水洗 1～2 s （3）蘇木精液染色（60℃） 30～60 s （4）流水洗去蘇木精液 5～10 s （5）1%鹽酸乙醇 1～3 s （6）稍水洗 1～2 s （7）促藍液返藍 5～10 s （8）流水沖洗 15～30 s （9）0.5%曙紅液染色 30～60 s （10）蒸餾水稍洗 1～2 s （11）80%乙醇 1～2 s （12）95%乙醇 1～2 s （13）無水乙醇 1～2 s （14）石炭酸二甲苯 2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ） 2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ） 2～3 s （17）中性樹膠封固。 注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無水乙醇，染色結(jié)果為：細胞核藍色、胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈深淺不一的紅色。 封片 切片染色后封片常用中性樹膠，酸性的樹膠可使胞核褪色，如樹膠放置時間過長，因氧化而變酸。中性樹膠可用二甲苯稀釋。樹膠過濃，封片時容易導致氣泡；過稀，封片時易使膠外溢，影響美觀，也會出現(xiàn)由于二甲苯揮發(fā)后缺膠的現(xiàn)象。 在整個染色過程中不讓切片干涸：切片完全干涸，會使組織收縮和出現(xiàn)裂痕即出現(xiàn)所謂“龜裂”現(xiàn)象。也會使部分細胞核透明不良，看起來像黑色的細胞核，即形成“黑核”。 冰凍切片制作方法改進探討 中華首席醫(yī)學網(wǎng) 2007年09月15日 05:59:39 Saturday 1119 作者：李建紅 石天峰 作者單位：長治醫(yī)學院病理教研室（046000） 長治衛(wèi)校 《長治醫(yī)學院學報》2007年8月22卷4期 臨床醫(yī)學 【摘要】 目的：探討制片效果比較理想的冰凍切片制作方法，以提高冰凍切片的質(zhì)量。方法：擇取新鮮活體組織，取材后直接凍結(jié)，經(jīng)恒溫式冰凍切片機切片，冰凍固定液固定，HE染色。剩余組織做石蠟切片對照。結(jié)果：質(zhì)量較好，染色鮮艷，鏡下組織結(jié)構(gòu)細胞形態(tài)清晰，細胞核漿對比分明。結(jié)論：此方法簡便快速，制片質(zhì)量滿意，可提高病理診斷的準確性。 【關(guān)鍵詞】 冰凍切片；制作；冰晶 冰凍切片的方法是一種最省時最快速的制片方法，因此主要用于臨床手術(shù)中的病理診斷。其原理是：冷凍使組織變硬以代替石蠟做浸蠟。將組織固定在標本托上短時間內(nèi)凍好進行切片。術(shù)中確診病變性質(zhì)，決定手術(shù)范圍，因此做出高質(zhì)量的冷凍切片至關(guān)重要。這就要求每個病理技術(shù)人員不僅要有高度的責任心，還要有熟練的技術(shù)，在最短時間內(nèi)制出高質(zhì)量的切片。我科在工作中，經(jīng)過反復試驗和不斷改進，摸索出一種制片效果比較理想的冰凍切片制作法，在術(shù)中病理診斷取得滿意的效果，現(xiàn)介紹如下。 1 材料與方法 1.1 材料 2006年我科完成的冰凍切片140例其中涉及到的組織標本有乳腺70例，卵巢55例，甲狀腺15例。采用德國萊卡恒溫式冷凍切片機。 1.2 方法 擇取新鮮活體組織取材后直接凍結(jié)、切片、即投入固定液（配制方法：40%福爾馬林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL）中，固定1 min～2 min，入蘇木素染核1 min～2 min，水洗后，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗后，0.1%氨水返藍，水洗后，入1%水溶性伊紅10 s左右，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封固。 2 結(jié)果 使用該方法所制冰凍切片速度明顯提高，切片質(zhì)量較好，染色鮮艷，鏡下組織結(jié)構(gòu)，細胞形態(tài)清晰，細胞核，細胞漿色彩鮮艷對比分明，術(shù)后診斷符合率達96%以上。 3 討論 病理技術(shù)是病理學診斷不可分割的一部分，制片質(zhì)量的好壞很大程度上影響病理醫(yī)生做出正確的病理診斷。因此，保證和提高制片質(zhì)量是每個病理技術(shù)員的責任。為了保證制片質(zhì)量，減少差錯，防范責任事故，避免醫(yī)療糾紛，有必要加強對病理技術(shù)進行科學規(guī)范管理和制片的控制。在冰凍切片方面我科主要從以下環(huán)節(jié)上加強質(zhì)控。 3.1 組織取材大小 組織塊大小適宜，理想取材大小為1.5 cm×1.5 cm，厚2 mm。組織過大，切片時阻力過大，易產(chǎn)生皺折，刀痕，組織易崩碎，增加制片難度，影響診斷。如需在同一標本托上放大小兩塊組織時，應盡量凍成一個平面，與刀鋒平齊，以防切片不完整，發(fā)生漏診。若送檢組織過小，請預先速凍一冷臺面，再行包埋，利于制片。 3.2 冷凍時間 速凍時間過長，切片呈碎屑或條痕狀，其處理方法是：切出完整平面后用戴乳膠手套的拇指按壓回溫，直到切片完整為止，反之，時間過短，切片呈粥糜狀或切不下來，則需繼續(xù)冷凍。 3.3 切片 切片時用力均勻，厚度約4 μm～5 μm，特殊要求時可達3 μm，切好的組織在干凈的玻片上粘附時可順著一個方向稍微用力輕輕一帶，可避免組織攤片過程中皺折，切好后立即放入提前配制好的冰凍切片固定液中及時固定1 min～2 min［１］。 3.4 染色 切片后做快速HE染色,蘇木素染色過程需加熱進行,一般1 min～2 min即可。這樣做出來的快速切片鏡下觀結(jié)構(gòu)完整、平坦、無皺折。細胞核與細胞質(zhì)染色色澤鮮艷,對比清晰,細胞無腫脹,無收縮,近似常規(guī)石蠟切片,封片時注意無氣泡及無溢液,切片整潔,標簽清楚端正,根據(jù)需要可切出半張玻璃片大小,厚薄均勻,一層細胞的組織切片［２］。 3.5 冰晶的形成致使無法及時準確地為臨床提供病理診斷依據(jù)。我們知道，生物體是由細胞構(gòu)成的，一般情況下，細胞中水分約占80%～90%，水在各種組織中含量最多，其解決方法為：①在不影響病理診斷的前提下，標本取材盡量小一些，組織厚度勿超過4 mm，這樣有利于組織的快速凍結(jié)，將組織塊快速移到冷凍頭上驟冷以縮短冷凍時間,減少冰晶現(xiàn)象出現(xiàn),有效防止冰晶擠壓周圍組織，改變甚至破壞組織原來的形態(tài)結(jié)構(gòu)［３］。②臨床科室若術(shù)中需要冰凍，應通知病理科，以便提前開機做好準備，這樣可避免由于緩慢冷凍所產(chǎn)生的冰晶。因為冷卻速度愈快，過冷溫度越低，所形成的晶核數(shù)量越多，晶體來不及生長就被凍結(jié)，從而失去了形成較大冰晶的機會。③需要術(shù)中進行快速病理診斷的活檢組織，最好用一次性塑料或乳膠手套盛放，切忌用紗布包裹組織，以免紗布上的線毛粘在組織上，不利于制片，且易損傷刀刃。④臨床醫(yī)師送檢標本盡量避開水源不要用生理鹽水浸泡或用濕紗布包裹組織，由于液體浸泡后，組織內(nèi)水分會增加，易造成冷凍后組織內(nèi)冰晶形成增多。組織送檢取材時，如遇含水量高的標本時，應盡量用干紗布吸干水分后再行冷凍，避免由于冰晶形成出現(xiàn)診斷上的失誤。 對于冰凍切片的質(zhì)量因素主要有以上幾點，固然還存在某些其他方面的因素。如果能正確對待以上幾方面的問題，冰凍切片的質(zhì)量方可得到保證，且能制備出一張質(zhì)量優(yōu)秀的切片，為明確病理診斷提供較為便利的客觀條件。 【參考文獻】 �。郏保� 駱新蘭.冰凍切片常見問題探討［Ｊ］.臨床與實驗病理學，1999,15(4):273. ［２］ 列增輝.病理染色技術(shù)［Ｊ］.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000：35. �。郏常� 田玉旺,丁華野．一種減少冷凍切片組織內(nèi)冰晶的處理方法［Ｊ］.臨床與實驗病理學雜志,2002,18(5):568. [search]藥理 冰凍 切片 HE 染色[/search] [ Last edited by jiangxizhongyao on 2008-7-3 at 21:45 ] |
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