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weleozhu銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
使用Sau3AI建立水稻shotgun庫(kù)，但連接多次不長(zhǎng)，求經(jīng)驗(yàn)大神幫助 已有1人參與
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| 我最近在構(gòu)建一個(gè)水稻的shotgun亞克隆文庫(kù)，質(zhì)粒來(lái)源是水稻的BAC文庫(kù)的一個(gè)BAC質(zhì)粒，使用的是PUC19作為載體，回收的片段為7-10K，酶切質(zhì)粒條件摸索得差不多了，在目的區(qū)域也有比較集中的片段，然后切膠回收后，連接到用BamHI酶切然后用NEB CIP脫磷的PUC19上，問(wèn)題就出在這，連接轉(zhuǎn)化后就是不見(jiàn)一個(gè)菌斑。 我轉(zhuǎn)化的菌株是XL1-Blue，用的是電轉(zhuǎn)化， 感受態(tài)效率已經(jīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，沒(méi)有問(wèn)題，符合建庫(kù)要求。最近被這個(gè)快煩死了，都快兩個(gè)月了，求求大神棒棒忙，或者改一下方案也行。問(wèn)題解決了加送金幣。 |
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2樓2016-01-18 17:23:56
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【答案】應(yīng)助回帖
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weleozhu: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以試試 2016-02-25 17:30:36
weleozhu: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以試試 2016-02-25 17:30:36
| 今天又看到了該帖，再次說(shuō)一下我的觀點(diǎn)。我建議你換一管新的BamHI 沒(méi)切載體試一下，然后做一個(gè)NEB CIP脫磷前PUC19載體的自連實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化后看載體的自連率有多高。上述實(shí)驗(yàn)失敗，有可能是載體完全沒(méi)有切開(kāi)，片段沒(méi)法連接進(jìn)去，用CIP脫磷處理后，也不存在載體自連接的情況，故轉(zhuǎn)化后一個(gè)菌落都沒(méi)有。以前我們實(shí)驗(yàn)室也碰到過(guò)這樣的情況。載體酶切時(shí)適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)酶切的時(shí)間，連接時(shí)置入4℃冰箱，延長(zhǎng)連接的時(shí)間。 |
3樓2016-02-25 08:43:25
weleozhu
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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4樓2016-02-25 17:29:49
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