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weleozhu銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
使用Sau3AI建立水稻shotgun庫，但連接多次不長，求經(jīng)驗(yàn)大神幫助 已有1人參與
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| 我最近在構(gòu)建一個(gè)水稻的shotgun亞克隆文庫，質(zhì)粒來源是水稻的BAC文庫的一個(gè)BAC質(zhì)粒，使用的是PUC19作為載體，回收的片段為7-10K，酶切質(zhì)粒條件摸索得差不多了，在目的區(qū)域也有比較集中的片段，然后切膠回收后，連接到用BamHI酶切然后用NEB CIP脫磷的PUC19上，問題就出在這，連接轉(zhuǎn)化后就是不見一個(gè)菌斑。 我轉(zhuǎn)化的菌株是XL1-Blue，用的是電轉(zhuǎn)化， 感受態(tài)效率已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證，沒有問題，符合建庫要求。最近被這個(gè)快煩死了，都快兩個(gè)月了，求求大神棒棒忙，或者改一下方案也行。問題解決了加送金幣。 |
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weleozhu
銀蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 457.2
- 帖子: 92
- 在線: 35.3小時(shí)
- 蟲號: 1978180
- 注冊: 2012-09-05
- 專業(yè): 作物種質(zhì)資源與遺傳育種學(xué)
4樓2016-02-25 17:29:49
2樓2016-01-18 17:23:56
【答案】應(yīng)助回帖
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weleozhu: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以試試 2016-02-25 17:30:36
weleozhu: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以試試 2016-02-25 17:30:36
| 今天又看到了該帖，再次說一下我的觀點(diǎn)。我建議你換一管新的BamHI 沒切載體試一下，然后做一個(gè)NEB CIP脫磷前PUC19載體的自連實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化后看載體的自連率有多高。上述實(shí)驗(yàn)失敗，有可能是載體完全沒有切開，片段沒法連接進(jìn)去，用CIP脫磷處理后，也不存在載體自連接的情況，故轉(zhuǎn)化后一個(gè)菌落都沒有。以前我們實(shí)驗(yàn)室也碰到過這樣的情況。載體酶切時(shí)適當(dāng)?shù)难娱L酶切的時(shí)間，連接時(shí)置入4℃冰箱，延長連接的時(shí)間。 |
3樓2016-02-25 08:43:25
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