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luffyheipi銀蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于構(gòu)建基因文庫(kù)中Sau3AI ， BamHI 均切不動(dòng)基因組DNA的問(wèn)題。 已有2人參與
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大家好！ 本人初次在小木蟲(chóng)上發(fā)帖，各方面如有不當(dāng)之處，還望大家包涵。先行謝過(guò)了！ 我最近在構(gòu)建一株細(xì)菌的基因組文庫(kù)，大量抽提了基因組DNA 5次，每次DNA的濃度均在1000-2000ng/ul之間，A260/280都在1.8-2.0之間，A260/230也都大于2.0.跑膠檢測(cè)，條帶很亮，均一，無(wú)拖帶。 然后，問(wèn)題來(lái)了。用Sau3AI預(yù)酶切時(shí)，酶切體系是20ul。但是，酶的稀釋比例從5-50倍，酶量2ul，時(shí)間從15-120min都試過(guò)，幾乎都切不動(dòng)，酶是新買的。少有的切動(dòng)的情況，想再次重復(fù)也重復(fù)不出來(lái)。之后，改用BamHI，50ul體系，3ul的酶，其他是buffer和DNA。酶切時(shí)間從8-24h也都切不動(dòng)。于是，想檢測(cè)一下基因組DNA有沒(méi)有什么問(wèn)題。用基因組DNA作模板，通用引物擴(kuò)增16S rDNA，都能擴(kuò)增出來(lái)。用DpnI酶切基因組DNA 1h，也切不動(dòng)。 以上是我遇到的問(wèn)題，以及嘗試解決問(wèn)題所做的努力。如有敘述不清楚之處，也請(qǐng)見(jiàn)諒！ 懇請(qǐng)有這方面的經(jīng)驗(yàn)的高手能給我一些指點(diǎn)和建議。將不勝感激！ |
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2樓2015-05-08 10:41:36
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3樓2015-11-13 21:36:35
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