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關于DNase1 去除提取的RNA中基因組DNA的問題 已有2人參與
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從細胞中提取的RNA,逆轉(zhuǎn)錄后PCR，沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞也總是可以擴增出我的目的條帶，這是什么原因？ 還有就是通過DNase1 可以去除基因組DNA嗎？去除后可以直接逆轉(zhuǎn)錄嗎，還是得純化后逆轉(zhuǎn)錄，那TAKARA的說明書實在是太復雜了。貌似第三步去除了基因組DNA后，第四步又開始了純化，實在是沒明白，求助大俠幫忙�。。�！ |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
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【答案】應助回帖
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小妞116(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖應助！ 2013-05-20 16:12:20
gyesang: 回帖置頂 2013-05-20 16:15:10
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gyesang: 回帖置頂 2013-05-20 16:15:10
| 不知道你的RNA是不是做realtime PCR，一般情況是，為了防止基因組被擴增，第一要去除RNA中的DNA,就是你正常抽出RNA，加入DNaseI和RNA抑制劑，同時處理后，就再重新加入RNAiso再抽提一輪就可以；第二在設計引物的時候要跨內(nèi)含子設計，該內(nèi)含子長度一般要超過1Kb，不然也會有非特異性擴增。不知道你是不是這樣的 |
3樓2013-05-16 20:14:50
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★
小妞116: 金幣+2, ★有幫助 2013-05-20 09:23:39
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-05-20 12:32:31
gyesang: 回帖置頂 2013-05-20 16:13:26
gyesang: 取消置頂 2013-05-20 16:16:38
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gyesang: 回帖置頂 2013-05-20 16:16:46
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提取的RNA沒有經(jīng)過DNase I消化的話肯定會有gDNA殘留的。 進行DNase I 消化后，是直接進行反轉(zhuǎn)錄或是再重新純化這取決于你的DNase I kit。 但進行滅活剩余的DNase I 是必須的，否則會將反轉(zhuǎn)錄合成的DNA也酶切掉。有些公司的可以稍為加熱滅活，有的公司加入一些失活劑，或者重新抽提一次。 向?qū)嶒炇易鲞^此類實驗的師兄師姐取取經(jīng)... |
5樓2013-05-20 09:12:12
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8樓2013-05-20 09:55:01
9樓2013-05-20 15:53:58
10樓2013-05-20 17:52:00
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