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杜仲谷木蟲 (職業(yè)作家)
金蟲
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[求助]
變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
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已經(jīng)一個(gè)星期了，每次都是溴酚藍(lán)的位置出現(xiàn)條帶被“壓縮”的現(xiàn)象，溴酚藍(lán)條帶成了非常直的一條線，而二甲苯青卻沒事。 我做的是EST-SSR的，PCR之后，6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。 （1）新配置的loading buffer配方如下： 含有去離子甲酰胺4.9ml， 溴酚藍(lán)0.0625g， 二甲苯青FF0.0625g， 0.5M的EDTA（pH8.0）1ml; 最終： 98%的去離子甲酰胺， 10mmol/L的EDTA 0.125%的溴酚藍(lán)， 0.125%的二甲苯青FF。 （2）電泳時(shí)候的緩沖液使用的是： 5×TBE稀釋成1×TBE， 每次都是上槽中使用新稀釋的1×TBE，下槽中不換， 且5×TBE沒有調(diào)整過pH,請(qǐng)問，這有影響嗎？？？ 5×TBE配方參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）配置，使用的是未滅菌的蒸餾水，請(qǐng)問需要使用滅過菌的去離子水嗎？ 因?yàn)榫彌_液很快就會(huì)用掉，所以沒有滅菌，且，緩沖液中本身就含有離子，所以，沒有使用去離子水，請(qǐng)問，這是導(dǎo)致我照片中現(xiàn)象的原因嗎？ （3）玻璃板也新買了兩組，仍然存在這個(gè)問題，這說明不是玻璃板的問題 （4）電壓150V，我的電泳槽是20cm長(zhǎng)，電場(chǎng)強(qiáng)度是7.5V/cm.每次都是這個(gè)電場(chǎng)強(qiáng)度，但是電流不是固定的，90mA,或者80mA都有可能，因?yàn)樵陔娪局�，玻璃板�?huì)發(fā)燙，電阻會(huì)有改變，電流無法一直保持恒定，所以電流是變化的，請(qǐng)問這是可能的因素嗎？請(qǐng)問大家是怎么設(shè)置電泳電壓和電流的？ （5）凝膠配方： ①40%的母液配方：聚丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺（37.5:1）干粉40g，加入滅菌的去離子水，配置成100ml母液，4℃保存。請(qǐng)問是因?yàn)?7.5:1而導(dǎo)致的這種結(jié)果嗎？文獻(xiàn)中多用的29：1，我懷疑是這個(gè)原因。 ②6%變性聚丙烯酰胺配方： 生工的尿素169.4g, 40%聚丙烯酰胺凝膠母液60mL, 5×TBE緩沖液80ml, 滅菌的去離子水定容至400ml, 充分溶解尿素，混勻，4℃保存。 最終，尿素是7mol/L。 懷疑，尿素是生工的產(chǎn)品，是不是尿素純度不夠？我訂購(gòu)的是分子生物級(jí)別的，感覺也不像是這個(gè)問題，請(qǐng)問大家用誰(shuí)家的尿素？Sigma的嗎？ （6）凝膠時(shí)間： 50ml的6%變性聚丙烯酰胺凝膠液體， 50μL的TEMED， 1ml的20%過硫酸銨（APS）新配置的溶液（每次都是使用2mL的ep管做容器，加入過硫酸銨固體，固體的量鋪滿ep管底部即可，并不進(jìn)行準(zhǔn)確稱量，大約0.2g，滅過菌的去離子水1ml，新配置，混勻。注：過硫酸銨因?yàn)橛卸拘�，在通風(fēng)櫥中操作，且不準(zhǔn)確稱量，因?yàn)楦鶕?jù)多次實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，鋪滿2ml的ep管底部即約為0.2g） 灌注凝膠之前，注射器反復(fù)抽吸、吹打3次，以確保各成分混勻。 用注射器吸取足量的凝膠，一次性灌注成功，堅(jiān)決避免了兩次灌注。插上梳子，過夜凝固。 且，電泳結(jié)束以后，拆開玻璃板，仔細(xì)檢查凝膠，看不到凝膠有分層的現(xiàn)象。 請(qǐng)問大家又沒有誰(shuí)清楚這個(gè)原因？ 我愿意補(bǔ)償金幣給您的回復(fù)。謝謝了！比較著急 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] 電泳結(jié)束（第1塊膠）.JPG 電泳結(jié)束（第2塊膠）.JPG 2015-5-8預(yù)電泳.JPG 2015-5-7拆下玻璃板（第1塊膠）.JPG 2015-5-7拆下玻璃板（第2塊膠）.JPG IMG_9874.JPG IMG_9877.JPG |
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