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杜仲谷

木蟲 (職業(yè)作家)

金蟲

應助: 11 (小學生)
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帖子: 4118
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蟲號: 1852699
注冊: 2012-06-08
性別: MM
專業(yè): 生物化學

[求助] 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

已經(jīng)一個星期了，每次都是溴酚藍的位置出現(xiàn)條帶被“壓縮”的現(xiàn)象，溴酚藍條帶成了非常直的一條線，而二甲苯青卻沒事。
我做的是EST-SSR的，PCR之后，6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
（1）新配置的loading buffer配方如下：
含有去離子甲酰胺4.9ml，
溴酚藍0.0625g，
二甲苯青FF0.0625g，
0.5M的EDTA（pH8.0）1ml;
最終：
98%的去離子甲酰胺，
10mmol/L的EDTA
0.125%的溴酚藍，
0.125%的二甲苯青FF。
（2）電泳時候的緩沖液使用的是：
5×TBE稀釋成1×TBE，
每次都是上槽中使用新稀釋的1×TBE，下槽中不換，
且5×TBE沒有調(diào)整過pH,請問，這有影響嗎？？？
5×TBE配方參考《分子克隆實驗指南》（第三版）配置，使用的是未滅菌的蒸餾水，請問需要使用滅過菌的去離子水嗎？
因為緩沖液很快就會用掉，所以沒有滅菌，且，緩沖液中本身就含有離子，所以，沒有使用去離子水，請問，這是導致我照片中現(xiàn)象的原因嗎？
（3）玻璃板也新買了兩組，仍然存在這個問題，這說明不是玻璃板的問題
（4）電壓150V，我的電泳槽是20cm長，電場強度是7.5V/cm.每次都是這個電場強度，但是電流不是固定的，90mA,或者80mA都有可能，因為在電泳中，玻璃板會發(fā)燙，電阻會有改變，電流無法一直保持恒定，所以電流是變化的，請問這是可能的因素嗎？請問大家是怎么設置電泳電壓和電流的？
（5）凝膠配方：
①40%的母液配方：聚丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺（37.5:1）干粉40g，加入滅菌的去離子水，配置成100ml母液，4℃保存。請問是因為37.5:1而導致的這種結(jié)果嗎？文獻中多用的29：1，我懷疑是這個原因。
②6%變性聚丙烯酰胺配方：
生工的尿素169.4g,
40%聚丙烯酰胺凝膠母液60mL,
5×TBE緩沖液80ml,
滅菌的去離子水定容至400ml,
充分溶解尿素，混勻，4℃保存。
最終，尿素是7mol/L。
懷疑，尿素是生工的產(chǎn)品，是不是尿素純度不夠？我訂購的是分子生物級別的，感覺也不像是這個問題，請問大家用誰家的尿素？Sigma的嗎？
（6）凝膠時間：
50ml的6%變性聚丙烯酰胺凝膠液體，
50μL的TEMED，
1ml的20%過硫酸銨（APS）新配置的溶液（每次都是使用2mL的ep管做容器，加入過硫酸銨固體，固體的量鋪滿ep管底部即可，并不進行準確稱量，大約0.2g，滅過菌的去離子水1ml，新配置，混勻。注：過硫酸銨因為有毒性，在通風櫥中操作，且不準確稱量，因為根據(jù)多次實踐經(jīng)驗，鋪滿2ml的ep管底部即約為0.2g）
灌注凝膠之前，注射器反復抽吸、吹打3次，以確保各成分混勻。
用注射器吸取足量的凝膠，一次性灌注成功，堅決避免了兩次灌注。插上梳子，過夜凝固。
且，電泳結(jié)束以后，拆開玻璃板，仔細檢查凝膠，看不到凝膠有分層的現(xiàn)象。

請問大家又沒有誰清楚這個原因？
我愿意補償金幣給您的回復。謝謝了！比較著急
[ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ]

電泳結(jié)束（第1塊膠）.JPG

電泳結(jié)束（第2塊膠）.JPG

2015-5-8預電泳.JPG

2015-5-7拆下玻璃板（第1塊膠）.JPG

2015-5-7拆下玻璃板（第2塊膠）.JPG

IMG_9874.JPG

IMG_9877.JPG

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1樓 2015-05-10 09:07:56

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