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lwk5716鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[交流]
關(guān)于實驗中可變剪切的一些問題 已有1人參與
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| 各位前輩：我在幫師姐做實驗的過程中，遇到了一個問題。在擴增一個基因之后（用cDNA擴增），電泳發(fā)現(xiàn)只有一條帶，切膠回收后連接T載體，挑菌測序，發(fā)現(xiàn)有些片段少了一個內(nèi)含子，做了幾次，挑菌7,8個會有一個，有時候少的內(nèi)含子還不一樣。但是，擴增后跑1%或2%瓊脂糖膠只能看到一條帶，可變的那條帶比目的大小少100多bp，但是膠上就看不到那條帶，這是怎么回事��？在可變的內(nèi)含子上設(shè)計引物倒是能擴出可變的那條帶，只是全長就看不到了，是不是可變的比例占得小�。� |
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（用cDNA擴增），電泳發(fā)現(xiàn)只有一條帶，切膠回收后連接T載體，挑菌測序，發(fā)現(xiàn)有些片段少了一個內(nèi)含子——這里如果有內(nèi)含子，那么含內(nèi)含子的事一種mRNA,不含的是另一種，這樣來說應該是可變剪切；我之前做Race，克了20多個基因吧，也出現(xiàn)3個兩種片段的，差別也都不大……不過我的都是在末端差異……有很多種，也挺費解的，Race我做了半年，感覺疑惑挺多的。 “擴增后跑1%或2%瓊脂糖膠只能看到一條帶，可變的那條帶比目的大小少100多bp，但是膠上就看不到那條帶，這是怎么回事��？”如果條帶比較大，比如超過2000bp，那么個人認為100bp的差異在瓊脂糖中看不出來應該比較正常，我之前克基因的時候，單條帶連接轉(zhuǎn)化后，挑菌菌落PCR經(jīng)常會有分不出的差異……當然不是同一泳道，個人感覺或許你可以試試PAGE…… 如有不當請見諒…… |
13樓2015-05-18 20:44:56
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2樓2015-05-17 09:36:40
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-05-19 22:49:19
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有點不明白LZ的意思，你拿cDNA克隆，正常情況下就應該不帶內(nèi)含子的，又何來的少一個內(nèi)含子一說，是多一個內(nèi)含子吧。。。7 8個菌會有一個完全不帶內(nèi)含子的正常序列，還是7 8個菌里面會有一個不正常的帶內(nèi)含子的序列？ 這種可變剪切在你整個模板中肯定是少見的，所以在你整個PCR擴增過程中較少存在，以至于肉眼看不到帶，具體想驗證有多大的比例，用你內(nèi)含子上設(shè)計的引物，從你TA克隆的平板上挑上50—100個轉(zhuǎn)化子做個菌落PCR計算一下能擴增出帶的轉(zhuǎn)化子數(shù)即可推算出大概的比例。 |
8樓2015-05-17 22:50:36
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10樓2015-05-18 12:59:54
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