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zhangtt0530新蟲 (初入文壇)
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[求助]
DNA shuffling道路漫長痛苦，何時解脫？ 已有1人參與
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各位，有做過DNA shuffling的請幫我指點指點，經(jīng)歷了痛苦的三個月，實在是看不到希望，不知道什么時候能解脫。 簡單介紹下我的實驗背景：載體大小為8000bp，目的片段2500bp，7個模板DNA。DNaseI消化回收250-1000bp片段，無引物PCR電泳狀態(tài)為彌散帶，大小范圍高于DNaseI消化帶范圍。酶切位點HindIII/NotI。 我目前遇到的問題有兩個 1、有引物PCR擴增不穩(wěn)定，有時能擴增到目的條帶，有時無法擴增到目的條帶，擴增效率不穩(wěn)定 2、shuffled片段與載體無法連接，轉(zhuǎn)化效率低。單一模板用相同酶切位點引物擴增酶切后與載體連接，可以獲得90-100%陽性克隆，每次長出20個左右。shuffled片段連接轉(zhuǎn)化有時長幾個，PCR均為陰性，陽性率最高能達到20%。我認為與載體無關(guān)，問題很可能出在片段上。 求指點迷津。 |
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yuman0709
鐵蟲 (初入文壇)
- 應助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 79.8
- 帖子: 42
- 在線: 20.8小時
- 蟲號: 2749353
- 注冊: 2013-10-24
- 專業(yè): 微生物遺傳育種學
2樓2015-09-12 11:11:57
3樓2015-11-06 19:52:15
【答案】應助回帖
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我的pcr也和樓主一樣，大多數(shù)條帶彌散的，結(jié)果不穩(wěn)定偶爾p出一次目的條帶，p出的條帶稀釋100，1000倍2次pcr卻還是彌散，請問樓主這個問題是怎么解決的！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-11-19 01:33:52
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