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zhangtt0530新蟲 (初入文壇)
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[求助]
DNA shuffling道路漫長(zhǎng)痛苦，何時(shí)解脫？ 已有1人參與
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各位，有做過(guò)DNA shuffling的請(qǐng)幫我指點(diǎn)指點(diǎn)，經(jīng)歷了痛苦的三個(gè)月，實(shí)在是看不到希望，不知道什么時(shí)候能解脫。 簡(jiǎn)單介紹下我的實(shí)驗(yàn)背景：載體大小為8000bp，目的片段2500bp，7個(gè)模板DNA。DNaseI消化回收250-1000bp片段，無(wú)引物PCR電泳狀態(tài)為彌散帶，大小范圍高于DNaseI消化帶范圍。酶切位點(diǎn)HindIII/NotI。 我目前遇到的問(wèn)題有兩個(gè) 1、有引物PCR擴(kuò)增不穩(wěn)定，有時(shí)能擴(kuò)增到目的條帶，有時(shí)無(wú)法擴(kuò)增到目的條帶，擴(kuò)增效率不穩(wěn)定 2、shuffled片段與載體無(wú)法連接，轉(zhuǎn)化效率低。單一模板用相同酶切位點(diǎn)引物擴(kuò)增酶切后與載體連接，可以獲得90-100%陽(yáng)性克隆，每次長(zhǎng)出20個(gè)左右。shuffled片段連接轉(zhuǎn)化有時(shí)長(zhǎng)幾個(gè)，PCR均為陰性，陽(yáng)性率最高能達(dá)到20%。我認(rèn)為與載體無(wú)關(guān)，問(wèn)題很可能出在片段上。 求指點(diǎn)迷津。 |
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3樓2015-11-06 19:52:15
yuman0709
鐵蟲 (初入文壇)
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2樓2015-09-12 11:11:57
小小小小瓶瓶
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【答案】應(yīng)助回帖
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我的pcr也和樓主一樣，大多數(shù)條帶彌散的，結(jié)果不穩(wěn)定偶爾p出一次目的條帶，p出的條帶稀釋100，1000倍2次pcr卻還是彌散，請(qǐng)問(wèn)樓主這個(gè)問(wèn)題是怎么解決的！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-11-19 01:33:52
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