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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 醫(yī)學 » 綜合其他 » 原代肝細胞MTT實驗
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梅雪芳新蟲 (小有名氣)
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[交流]
原代肝細胞MTT實驗
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最近在分離小鼠原代肝細胞做MTT，但是遇到一些問題，我的操作過程如下： 1、無菌獲取乳鼠肝組織，剪碎至1mm3大小，4℃ DMEM清洗血 2、約2倍于肝組織體積的0.25%胰酶消化3min 3、DMEM-HG終止消化，離心，棄上清 4，加與胰酶同體積的0.1%的二型膠原酶，消化6min 5，DMEM-HG終止消化 6，靜置，待組織塊下沉，取出上清液，200目細胞篩過濾 7，濾液離心，棄上清 8，于沉淀中加入紅細胞裂解液，裂解3min 9，DMEM-HG終止裂解，離心，棄上清 10，加DMEM-HG重懸，臺盼藍計數(shù)，細胞數(shù)約達到7次方個 11,96孔板鋪板，每孔200uL，5*104個/孔 12，孵育12h后細胞貼壁良好，加5mg/ml MTT 20ul/孔 作用4h 13，棄上清，加150ul/孔 DMSO，振蕩10min 14，使用490nm讀數(shù)。 問題是，加入MTT作用4h以后，沒有形成藍紫色甲瓚結晶，顯微鏡下看，只有及少數(shù)細胞內(nèi)形成了結晶，讀數(shù)也只是0.1~0.3之間。 我考慮到的幾點原因是： 1，細胞濃度太小。因為我咨詢過做脾細胞相關實驗的，說是把細胞濃度調到了6次方/孔 2，細胞活力不好�？墒菑馁N壁性能來看，細胞活力應該也不會太差 3，細胞太雜，分離出來的時候明顯有枯否細胞、成纖維細胞等 不知道有沒有人做過相關實驗，可以交流或指導  |
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2樓2015-10-29 11:49:07
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